[發(fā)明專利]三倍體湘云鯽尾鰭細(xì)胞系3nFC及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710938834.0
• 申請日: 2017-09-30
• 公開（公告）號: CN107641612A
• 公開（公告）日: 2018-01-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馮浩;劉少軍;傅永明;肖軍;肖俊;周維;彭靈芝;吳慧
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南師范大學(xué)
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 長沙朕揚(yáng)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)43213
• 代理人: 楊斌

1.一種三倍體湘云鯽尾鰭細(xì)胞系3nFC，其保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO：C201732。

2.一種如權(quán)利要求1所述的三倍體湘云鯽尾鰭細(xì)胞系3nFC的構(gòu)建方法，主要包括以下步驟：

(1)從三倍體湘云鯽尾鰭進(jìn)行取材，消毒漂洗后剪成尾鰭組織小塊；

(2)將步驟(1)后得到的尾鰭組織小塊用胎牛血清浸泡后，在DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行原代培養(yǎng)；

(3)待步驟(2)后得到的細(xì)胞生長至形成單層后，加入胰酶進(jìn)行消化，終止消化后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法具體包括以下步驟：

(1)用體積濃度為70％～75％的酒精對要取材的三倍體湘云鯽尾鰭進(jìn)行消毒后，剪取尾鰭組織，用70％～75％的酒精浸泡，再用磷酸緩沖液漂洗后剪成0.5～1mm²的尾鰭組織小塊；

(2)將步驟(1)后得到的尾鰭組織小塊用磷酸緩沖液清洗，進(jìn)行離心，去上清，再用磷酸緩沖液重復(fù)清洗，加入尾鰭組織小塊5～10倍體積的胎牛血清浸泡15～30min，進(jìn)行離心，去上清后，將得到的尾鰭組織小塊均勻接種于培養(yǎng)皿底部，25℃下倒置干貼0.5～2h，往培養(yǎng)皿中加入DMEM培養(yǎng)基，置于25℃且含體積5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(3)當(dāng)細(xì)胞生長至形成單層后，去除培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基并加入磷酸緩沖液潤洗細(xì)胞，去除磷酸緩沖液，加入質(zhì)量濃度0.25％的胰酶消化，除去胰酶，加入DMEM培養(yǎng)基終止消化，用移液器輕輕吸打使細(xì)胞充分分離，以1：1.5～2的細(xì)胞數(shù)量比進(jìn)行傳代，然后仍置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待其再次長至單層后，依照上述方法再進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將得到的三倍體湘云鯽尾鰭細(xì)胞系3nFC進(jìn)行細(xì)胞凍存和細(xì)胞復(fù)蘇。

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述三倍體湘云鯽為3～9月齡的改良三倍體湘云鯽。

5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(2)和(3)中的DMEM培養(yǎng)基，其中還包括青霉素、鏈霉素、人堿性成纖維細(xì)胞生長因子和胎牛血清，使青霉素的濃度為100Iμ/mL，鏈霉素的濃度為100μg/mL，堿性成纖維細(xì)胞生長因子的濃度為10ng/mL，胎牛血清的體積占總體積的15％～30％。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述胎牛血清所占的比例根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞所處的代數(shù)來調(diào)整，第一代到第十代細(xì)胞用含有體積30％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，第十一代到第三十代細(xì)胞培用含有體積20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，第三十一代后的細(xì)胞用含有體積15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟(1)中，浸泡時間為10～40s，漂洗遍數(shù)為2～3遍；

所述步驟(2)中，離心使用的轉(zhuǎn)速為800～1000rpm，離心時間為3～5min，磷酸緩沖液重復(fù)清洗1～2次，定期更換培養(yǎng)基的方式是每隔4～6天更換培養(yǎng)皿中一半的培養(yǎng)基；

所述步驟(3)中，消化時間為1～2min。

8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述細(xì)胞凍存的具體步驟為：選取生長旺盛且細(xì)胞密度達(dá)到90％以上的一皿細(xì)胞，去除培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基并加入磷酸緩沖液潤洗細(xì)胞，去除磷酸緩沖液，加入質(zhì)量濃度0.25％的胰酶消化1～2min，除去胰酶，加入含有體積15～30％胎牛血清的新鮮DMEM終止消化，用移液器輕輕吸打使細(xì)胞充分分離，然后將細(xì)胞移入凍存管中，以轉(zhuǎn)速為800～1000rpm離心3～5min，去上清，用凍存液懸浮細(xì)胞，將凍存管置于凍存盒中，4℃條件下放置1～2h，然后移至-20℃條件下放置1～2h，再將其放到-80℃條件下放置12～24h，最后移至液氮罐中保存；所述凍存液中含體積20％的胎牛血清、10％二甲基亞砜和70％DMEM。

9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述細(xì)胞復(fù)蘇的具體步驟為：從液氮罐中取出保存的凍存管，將其管蓋朝上置于25℃水中融化，細(xì)胞完全融化后用移液器將其輕輕混勻，并轉(zhuǎn)入盛有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，放置于25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

10.一種如權(quán)利要求1所述或由權(quán)利要求2～9中任一項所述構(gòu)建方法得到的三倍體湘云鯽尾鰭細(xì)胞系3nFC在多倍體魚類抗病毒免疫研發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用。