[發(fā)明專(zhuān)利]外泌體蛋白CD5L的檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710935374.6
• 申請(qǐng)日: 2017-10-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107907689A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 紀(jì)建國(guó);王青松;費(fèi)丹霞
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 北京大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/68
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/68
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11002
• 代理人: 王文君,姚自奇

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)檢測(cè)領(lǐng)域，具體地，涉及一種外泌體蛋白CD5L的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

外泌體，是一種能被大多數(shù)細(xì)胞分泌的微小膜泡，具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，直徑大約40-100nm。最近幾年，人們發(fā)現(xiàn)這種微小膜泡中含有細(xì)胞特異的蛋白，能作為信號(hào)分子傳遞給其他細(xì)胞從而改變其他細(xì)胞的功能。常常用于鑒定外泌體的經(jīng)典的Marker有CD9，CD81，CD63，HSP70，TSG101等。這些發(fā)現(xiàn)點(diǎn)燃了人們對(duì)細(xì)胞分泌膜泡的興趣。最近的研究發(fā)現(xiàn)外泌體在很多生理病理機(jī)制中起著重要的作用，如免疫中抗原呈遞、腫瘤的生長(zhǎng)與遷移、組織損傷的修復(fù)等。不同細(xì)胞分泌的外泌體具有不同的組成成分和功能，可作為疾病診斷的生物標(biāo)志物。

隨著外泌體特異性蛋白研究的逐漸興起，許多新型蛋白被發(fā)現(xiàn)，血清外泌體膜表面除含有CD9，CD63和CD81標(biāo)志蛋白外，還含有新型的特定標(biāo)記蛋白，如黑色素瘤患者體內(nèi)血清外泌體中特定表達(dá)caveolin-1蛋白，人體血細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體上的特異性蛋白CD34+，尿液外泌體上特異性的蛋白CD24等。

目前，血清外泌體的分離主要有基于超速離心的分離技術(shù)，基于分子大小的分離技術(shù)(色譜法)，PEG沉淀法，基于免疫吸附的分離技術(shù)等。離心法對(duì)外泌體得率較高，但其耗時(shí)耗力，不適合大量樣本操作。色譜法提取的外泌體純度較高，但其分離易受雜蛋白干擾,操作穩(wěn)定性差。大分子聚合物沉淀外泌體耗時(shí)短，所得外泌體純度低，并且不能高通量的比較不同樣本中外泌體的含量。

因此開(kāi)發(fā)出高靈敏度、高選擇性、價(jià)錢(qián)低廉、直接測(cè)定血清中外泌體的CD5L的方法引起了人們的研究興趣。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種外泌體蛋白CD5L的檢測(cè)方法，優(yōu)點(diǎn)是所需樣本量小，同時(shí)檢測(cè)所用設(shè)備成本低、小型化，可高通量、特異性地檢測(cè)含有CD5L蛋白的特定外泌體含量，對(duì)外泌體的臨床檢測(cè)應(yīng)用具有重要意義。

本發(fā)明的基本思想是使用酶聯(lián)免疫吸附的方法定量檢測(cè)血清外泌體中所含CD5L的量。

本發(fā)明提供了一種外泌體蛋白CD5L的檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟：

1)預(yù)處理，取新鮮血清，經(jīng)離心，初步去除雜質(zhì)，取上清，進(jìn)行超聲破碎；

2)于固相載體(例如96孔酶標(biāo)板)上包被單克隆抗體CD5L；

3)向步驟2)所得固相載體上(例如96孔酶標(biāo)板)加入封閉液進(jìn)行封閉；

4)向步驟3)封閉之后的固相載體(例如96孔酶標(biāo)板)中加入步驟1)預(yù)處理的血清，孵育；

5)向步驟4)封閉之后的固相載體(例如96孔酶標(biāo)板)中加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，孵育；

6)在步驟5)中得到的產(chǎn)物在加入TMB(3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺)顯色液，顯色，檢測(cè)OD值(如用酶標(biāo)儀)。

進(jìn)一步地，步驟1)包括室溫下取新鮮血清，與室溫條件下離心，3000g，30分鐘；初步去除雜質(zhì)，取上清；將上清與含1％脫脂奶的PBS按照體積比1∶29進(jìn)行稀釋?zhuān)缓筮M(jìn)行超聲破碎。

進(jìn)一步地，所述超聲破碎條件為5s on(開(kāi))，5s off(關(guān))，即間隔5s開(kāi)關(guān)一次，至少60cycles(循環(huán))，low frequncy(低頻)。

進(jìn)一步地，步驟2)中固相載體上所述包被蛋白即包被單克隆抗體CD5L的含量為200ng/孔；包被溫度為4℃，包被時(shí)間為12小時(shí)，包被稀釋液為碳酸鹽緩沖液。

進(jìn)一步地，步驟3)所述固相載體(例如96孔酶標(biāo)板)需要經(jīng)過(guò)PBST(10％tween 20溶于PBS)洗滌至少5遍；步驟3)所述封閉液為含5％脫脂奶的PBS，封閉時(shí)間為2小時(shí)。

進(jìn)一步地，步驟4)所述固相載體(例如96孔酶標(biāo)板)需要經(jīng)過(guò)PBST(10％tween 20溶于PBS)洗滌至少3遍；步驟4)所述預(yù)處理的血清添加量與包被單克隆抗體CD5L的質(zhì)量比為(70～100ug):200ng；孵育時(shí)間優(yōu)選為3.5小時(shí)。

進(jìn)一步地，步驟5)所述辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗用含1％脫脂奶的PBS按照1∶3500的比例稀釋?zhuān)跤龝r(shí)間優(yōu)選為1.5小時(shí)。

進(jìn)一步地，步驟6)中加入的TMB顯色液與所述包被單克隆抗體CD5L的體積質(zhì)量比為100ul:200ng；37℃，孵育至少10分鐘，加入50mM H₂SO₄終止反應(yīng)，于450nm處檢測(cè)OD值。

若無(wú)特殊指明，本發(fā)明所述TMB顯色液購(gòu)自美國(guó)Amresco公司。

本發(fā)明的技術(shù)特點(diǎn)在于：