[發(fā)明專利]外泌體蛋白CD5L的檢測方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710935374.6
• 申請日: 2017-10-10
• 公開（公告）號: CN107907689A
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 紀建國;王青松;費丹霞
• 申請（專利權(quán)）人: 北京大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11002
• 代理人: 王文君,姚自奇

1.一種外泌體蛋白CD5L的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)預(yù)處理，取新鮮血清，經(jīng)離心，初步去除雜質(zhì)，取上清，進行超聲破碎；

2)于固相載體上包被單克隆抗體CD5L；

3)向步驟2)所得固相載體上加入封閉液進行封閉；

4)向步驟3)封閉之后的固相載體中加入步驟1)預(yù)處理的血清，孵育；

5)向步驟4)封閉之后的固相載體中加入辣根過氧化物酶標記的二抗，孵育；

6)在步驟5)中得到的產(chǎn)物在加入TMB顯色液顯色，檢測OD值。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外泌體蛋白CD5L的檢測方法，其特征在于，步驟1)將所述上清與含1％脫脂奶的PBS按照體積比1:29進行稀釋，然后進行超聲破碎；

優(yōu)選地，所述超聲破碎條件為間隔5s開關(guān)一次，至少60循環(huán)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的外泌體蛋白CD5L的檢測方法，其特征在于，步驟1)所述離心在室溫或4℃條件下進行，3000g，30分鐘。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的外泌體蛋白CD5L的檢測方法，其特征在于，步驟2)中固相載體上所述包被單克隆抗體CD5L的含量為200ng/孔；包被稀釋液為碳酸鹽緩沖液；優(yōu)選地，包被溫度為4℃，包被時間為12小時。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的外泌體蛋白CD5L的檢測方法，其特征在于，步驟3)所述固相載體需要經(jīng)過PBST洗滌至少5遍；所述封閉液為含5％脫脂奶的PBS；優(yōu)選地，封閉時間為2小時。

6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的外泌體蛋白CD5L的檢測方法，其特征在于，步驟4)所述固相載體需要經(jīng)過PBST洗滌至少3遍；步驟4)所述預(yù)處理的血清添加量與包被單克隆抗體CD5L的質(zhì)量比為(70～100ug):200ng；孵育時間優(yōu)選為3.5小時。

7.據(jù)權(quán)利要求1或2所述的外泌體蛋白CD5L的檢測方法，其特征在于，步驟5)所述辣根過氧化物酶標記的二抗用含1％脫脂奶的PBS按照1:3500的比例稀釋，孵育時間優(yōu)選為1.5小時。

8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的外泌體蛋白CD5L的檢測方法，其特征在于，步驟6)中加入的TMB顯色液與所述包被單克隆抗體CD5L的體積質(zhì)量比為100ul:200ng；優(yōu)選加入TMB顯色液后于37℃，孵育至少10分鐘，然后加入50mM H₂SO₄終止反應(yīng)。

9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項所述的外泌體蛋白CD5L的檢測方法，其特征在于，于450nm處檢測OD值。