[發(fā)明專利]小球藻鄰苯二酚1,2-雙加氧酶的提取以及活性測定

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710935082.2
• 申請日: 2017-10-10
• 公開（公告）號: CN107794250B
• 公開（公告）日: 2020-11-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳慶國;王亞超;李晶晶;劉梅;陶玲;國青青
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江海洋大學(xué)
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12Q1/26
• 代理公司: 北京國翰知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11696
• 代理人: 呂彩霞

本發(fā)明公開了小球藻鄰苯二酚1,2?雙加氧酶的提取以及活性測定，提取的具體步驟為：將小球藻粉低溫研磨，加入Tris?HCl緩沖液，離心得胞內(nèi)酶粗酶液；將粗酶液濾，濃縮，透析，上樣到纖維素柱，洗脫，濃縮，透析，濃縮，上樣到Mono?Q柱，洗脫，透析，濃縮，干燥，即得鄰苯二酚1,2?雙加氧酶。小球藻鄰苯二酚1,2?雙加氧酶的酶活性測定方法為：將反應(yīng)體系在水浴中反應(yīng)，測定產(chǎn)物的生成量。有益效果為：本發(fā)明的提取鄰苯二酚1,2?雙加氧酶的方法除雜率高、條件溫和、純度高，能較好地保持酶的活性，并能維持酶之間的相互作用，具有較大發(fā)展?jié)摿?；該酶的活性測定簡單可行。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及鄰苯二酚1,2-雙加氧酶，尤其是涉及小球藻鄰苯二酚1,2-雙加氧酶的提取以及活性測定。

背景技術(shù)

鄰苯二酚（C₆H₆O₂）又名兒茶酚，是苯的兩個鄰位氫被羥基取代后形成的化合物，一般以衍生物的形式廣泛存在于自然界中，是芳香類物質(zhì)降解的重要中間產(chǎn)物。鄰苯二酚及其衍生物是一類重要的化工產(chǎn)品，可廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、農(nóng)藥、食品、香料、化學(xué)助劑等方面。由于鄰苯二酚能在各行業(yè)中廣泛應(yīng)用，鄰苯二酚的需求量隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展也與日俱增，各類廢水的排放量及復(fù)雜度也隨著增大。而鄰苯二酚屬于高毒性物質(zhì)，少量鄰苯二酚經(jīng)皮膚吸收就會引起濕疹性皮炎，鄰苯二酚可經(jīng)皮膚、呼吸道和消化道進入生物體，含有鄰苯二酚的廢水都具有致癌、致崎、致突變等潛在危害。所以，工業(yè)中鄰苯二酚釋放到土壤和水體中，通過富集作用，不僅污染環(huán)境，還會對人類的生存發(fā)展構(gòu)成威脅，具有類激素作用，導(dǎo)致內(nèi)分泌紊亂而危害生物健康。且隨著生產(chǎn)和使用量的增加，進入環(huán)境中的鄰苯二酚也相應(yīng)增加，環(huán)境中鄰苯二酚的污染危害日漸嚴重，因此，環(huán)境中鄰苯二酚的有效去除已引起人們的廣泛關(guān)注。

目前，在生物降解處理鄰苯二酚中的最主要的途徑之一，即為：在鄰位開環(huán)代謝途徑（ortho-pathway）中，鄰苯二酚1,2-雙加氧酶催化裂解鄰苯二酚，形成順,順-粘糠酸中間物，該中間產(chǎn)物在后隨相應(yīng)酶的逐級降解作用下，被降解為琥珀酸和乙酰輔酶A。因此，如何制備高純度的鄰苯二酚1,2-雙加氧酶是有效治理水污染的手段之一。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供小球藻鄰苯二酚1,2-雙加氧酶的提取以及活性測定，該提取方法除雜率高、條件溫和、能較好地保持酶的活性，所提取的鄰苯二酚1,2-雙加氧酶的純度高，此外，酶的活性測定簡單可行。

本發(fā)明針對背景技術(shù)中提到的問題，采取的技術(shù)方案為：小球藻鄰苯二酚1,2-雙加氧酶的提取，包括胞內(nèi)酶粗酶液制備、濃縮透析、首次純化、二次純化，提取的具體步驟為：

胞內(nèi)酶粗酶液制備：將對數(shù)期后期小球藻液抽濾，烘干得小球藻粉，然后在2-5℃下研磨5-15min，再加入pH為7.8-8.2的Tris-HCl緩沖液，小球藻粉與Tris-HCl緩沖液的重量體積比為1:1.8-2.3，混合均勻后在溫度為2-5℃、轉(zhuǎn)速為8000-12000r/min的條件下離心10-20min，上清液即為胞內(nèi)酶粗酶液，該步驟在低溫狀態(tài)下研磨小球藻粉，可快速破碎細胞壁，使小球藻細胞內(nèi)的酶能快速釋放出來，可操作性強，同時該步驟中緩沖液對酶的溶解度高，夠防止pH值的劇烈波動，保護胞內(nèi)鄰苯二酚1,2-雙加氧酶的生物活性不受損害，有利于鄰苯二酚1,2-雙加氧酶的提取，可有效抑制酶的降解，并能維持酶之間的相互作用；

濃縮透析：將胞內(nèi)酶粗酶液經(jīng)0.15-0.3μm微孔濾膜過濾，再用聚乙二醇PEG 20000濃縮，并用濃度為9-11mmol/L、pH為6.8-7.2的磷酸鹽緩沖液透析12-18h，即得鄰苯二酚1,2-雙加氧酶的粗品，該步驟微孔濾膜可過濾去除多余菌體，減少酶粗品中的雜質(zhì)，濃縮時吸收劑只是吸收透析袋中滲出小分子溶劑，吸水劑干燥后可繼續(xù)反復(fù)使用，同時該步驟可簡單、快速地更換酶的緩沖液，且對酶的生物活性無影響，具有成本低、操作方便、條件溫和、能較好地保持酶的活性、回收率高等優(yōu)點；