[發明專利]小球藻鄰苯二酚1,2-雙加氧酶的提取以及活性測定

有效

• 申請號: 201710935082.2
• 申請日: 2017-10-10
• 公開（公告）號: CN107794250B
• 公開（公告）日: 2020-11-17
• 發明（設計）人: 陳慶國;王亞超;李晶晶;劉梅;陶玲;國青青
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12Q1/26
• 代理公司: 北京國翰知識產權代理事務所(普通合伙) 11696
• 代理人: 呂彩霞

1.小球藻鄰苯二酚1,2-雙加氧酶的提取，包括胞內酶粗酶液制備、濃縮透析、首次純化、二次純化，其特征在于：

胞內酶粗酶液制備：將對數期后期小球藻液抽濾，烘干得小球藻粉，然后在2-5℃下研磨5-15min，再加入pH為7.8-8.2的Tris-HCl緩沖液，小球藻粉與Tris-HCl緩沖液的重量體積比為1:1.8-2.3，混合均勻后在溫度為2-5℃、轉速為8000-12000r/min的條件下離心10-20min，上清液即為胞內酶粗酶液；

濃縮透析：將胞內酶粗酶液經0.15-0.3μm微孔濾膜過濾，再用聚乙二醇PEG20000濃縮，并用濃度為9-11mmol/L、pH為6.8-7.2的磷酸鹽緩沖液透析12-18h，即得鄰苯二酚1,2-雙加氧酶的粗品；

首次純化：先用濃度為13-17mmol/L、pH為7.0-7.5的磷酸緩沖液對DEAE纖維素柱平衡，然后將鄰苯二酚1,2-雙加氧酶粗品上樣到纖維素柱上，用濃度為24-27mmol/L、pH為7.3-7.7的磷酸緩沖液洗脫，經聚乙二醇PEG20000濃縮后，再用濃度為9-11mmol/L、pH為6.8-7.2的磷酸緩沖液透析12-24h，最后用超濾膜再次濃縮即可；

二次純化：用含有0.11-0.13mmol/L水合肼、濃度為4-6mmol/L、pH為7.3-7.7的磷酸緩沖液對Mono-Q柱平衡后，將首次純化后的鄰苯二酚1,2-雙加氧酶粗品上樣，用濃度為24-27mmol/L、pH為7.3-7.7的磷酸緩沖液洗脫，再用濃度為9-11mmol/L、pH為6.8-7.2的磷酸緩沖液透析12-24h，最后用超濾膜濃縮，干燥，即得鄰苯二酚1,2-雙加氧酶。