[發(fā)明專利]基于酶與氧化石墨烯適配體傳感器檢測凝血酶的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710935015.0
• 申請日: 2017-10-10
• 公開（公告）號: CN107764790B
• 公開（公告）日: 2020-01-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃珊;肖琦;姚建東
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西師范學(xué)院
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 11369 北京遠(yuǎn)大卓悅知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)
• 代理人: 靳浩

本發(fā)明公開了一種基于酶與氧化石墨烯適配體傳感器檢測凝血酶的方法，包括以下步驟：步驟一、制備n份不同濃度的凝血酶標(biāo)準(zhǔn)溶液；步驟二、制備n份待檢測標(biāo)準(zhǔn)溶液，具體為：將雙鏈DNA溶液分為n份，并分別一一對應(yīng)添加相同體積的不同濃度的凝血酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，得多份凝血酶雙鏈DNA溶液，向每份凝血酶雙鏈DNA溶液中依次加入熒光素標(biāo)記DNA溶液、內(nèi)切酶Nb.BbvCI、及CutSmar緩沖液，繼續(xù)添加氧化石墨烯分散液，得多份待檢測標(biāo)準(zhǔn)溶液；步驟三、繪制線性方程。本發(fā)明具有方法操作簡單、檢測快速且靈敏度高，能進(jìn)行混合樣品溶液中對凝血酶的高靈敏識別，對凝血酶的檢出限達(dá)0.39×10^?9mol/L。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及凝血酶檢測技術(shù)領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種基于酶與氧化石墨烯適配體傳感器檢測凝血酶的方法。

背景技術(shù)

抗體雖然用于生物識別元件從發(fā)現(xiàn)到發(fā)展已有70多年，但是一系列缺陷(儲存時間短、易降解、對pH、溫度、酸堿度敏感等)不可避免地擺在人們面前。在生物檢測中理想的傳感器模型應(yīng)該是響應(yīng)快、耗時短、靈敏度高、易于小型化的，發(fā)展能夠克服抗體的缺陷的類抗體物逐漸成為研究的熱門。核酸適配體因親和力強(qiáng)、特異性高、獲得途徑簡單、穩(wěn)定性好等諸多優(yōu)點(diǎn)，成為了最具潛力替代抗體的生物分子識別物質(zhì)，使其在近年得到了快速發(fā)展。

目前，研究如何利用適配體作為傳感器建立高效、高靈敏、高特異性的的檢測目標(biāo)分子的新方法成為新趨勢。本文選用凝血酶作為研究模型，建立利用適配體傳感器檢測的新方法。凝血酶是一種重要的多功能蛋白酶，催化纖維蛋白原轉(zhuǎn)化撐纖維蛋白，參與凝血聯(lián)級過程的各個環(huán)節(jié)，促進(jìn)凝血，在生物、化學(xué)、藥理等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，濃度變化異常會導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生，如血栓、彌散性小管內(nèi)凝血等，因此血液中凝血酶含量的測定對人體健康非常重要。傳統(tǒng)的檢測凝血酶方法技術(shù)復(fù)雜，時間長，近年來，利用適配體凝血酶的檢測方法也非常多，但仍存在操作方法復(fù)雜、反應(yīng)時間長、靈敏度不高等缺陷。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明還有一個目的是提供一種方法操作簡單、檢測快速且靈敏度高，能進(jìn)行混合樣品溶液中對凝血酶的高靈敏識別，對凝血酶的檢出限達(dá)0.39×10^-9mol/L。

為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一種基于酶與氧化石墨烯適配體傳感器檢測凝血酶的方法，包括以下步驟：

步驟一、制備n份不同濃度的凝血酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中，n≥2；

步驟二、制備n份待檢測標(biāo)準(zhǔn)溶液，具體為：向雙鏈DNA溶液分為n份，并分別一一對應(yīng)添加相同體積的不同濃度的凝血酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，控制溫度為35-39℃，混合25-35min后，得多份凝血酶雙鏈DNA溶液，向每份凝血酶雙鏈DNA溶液中依次加入熒光素標(biāo)記DNA溶液、內(nèi)切酶Nb.BbvCI、及CutSmar緩沖液，控制溫度為35-39℃，反應(yīng)110-130min，繼續(xù)添加氧化石墨烯分散液，靜置6-10min后得多份待檢測標(biāo)準(zhǔn)溶液。

優(yōu)選的是，步驟二中雙鏈DNA溶液的制備方法具體為：將凝血酶適配體DNA溶液加入緩沖溶液中并加入互補(bǔ)單鏈DNA溶液，升溫至93-97℃后緩慢冷卻至室溫，得雙鏈DNA溶液，其中，緩沖溶液為pH為7.4，濃度為0.075mol/L的Tris-HCl緩沖溶液，凝血酶適配體DNA溶液和互補(bǔ)單鏈DNA溶液體積比為1：1，濃度比為1:1。