[發明專利]基于酶與氧化石墨烯適配體傳感器檢測凝血酶的方法

有效

• 申請號: 201710935015.0
• 申請日: 2017-10-10
• 公開（公告）號: CN107764790B
• 公開（公告）日: 2020-01-10
• 發明（設計）人: 黃珊;肖琦;姚建東
• 申請（專利權）人: 廣西師范學院
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 11369 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 靳浩

1.一種基于酶與氧化石墨烯適配體傳感器檢測凝血酶的方法，包括以下步驟：步驟一、制備n份不同濃度的凝血酶標準溶液，其中，n≥2；步驟二、制備n份待檢測標準溶液；其特征在于，制備n份待檢測標準溶液具體為：向雙鏈DNA溶液分為n份，并分別一一對應添加相同體積的不同濃度的凝血酶標準溶液，控制溫度為35-39℃，混合25-35min后，得多份凝血酶雙鏈DNA溶液，向每份凝血酶雙鏈DNA溶液中依次加入熒光素標記DNA溶液、內切酶Nb.BbvCI、及CutSmar緩沖液，控制溫度為35-39℃，反應110-130min，繼續添加氧化石墨烯分散液，靜置6-10min后得多份待檢測標準溶液。

2.如權利要求1所述的基于酶與氧化石墨烯適配體傳感器檢測凝血酶的方法，其特征在于，步驟二中雙鏈DNA溶液的制備方法具體為：將凝血酶適配體DNA溶液加入緩沖溶液中并加入互補單鏈DNA溶液，升溫至93-97℃后緩慢冷卻至室溫，得雙鏈DNA溶液，其中，緩沖溶液為pH為7.4，濃度為0.075mol/L的Tris-HCl緩沖溶液，凝血酶適配體DNA溶液和互補單鏈DNA溶液體積比為1：1，濃度比為1:1。

3.如權利要求2所述的基于酶與氧化石墨烯適配體傳感器檢測凝血酶的方法，其特征在于，步驟一中，n＝10，10份凝血酶標準溶液的濃度分別為：0mol/L，5×10^-10mol/L，1×10^-9mol/L，2×10^-9mol/L，5×10^-9mol/L，1×10^-8mol/L，2×10^-8mol/L，4×10^-8mol/L，6×10^-8mol/L，1×10^-7mol/L；

步驟二中，將雙鏈DNA溶液分為10份，每份中加入的凝血酶標準溶液的體積均為20μl，10份待檢測標準溶液中雙鏈DNA的濃度均為1×10^-8mol/L，熒光素標記DNA的濃度均為1.5×10^-8mol/L，氧化石墨烯的濃度均為65mg/ml，內切酶Nb.BbvCI為10U。

4.如權利要求1所述的基于酶與氧化石墨烯適配體傳感器檢測凝血酶的方法，其特征在于，還包括：步驟三、繪制線性方程，具體為：

設定激發波長為496nm，激發狹縫和發射狹縫均為10nm，用RF-6000熒光分光光度計，檢測每份待檢測標準溶液的熒光光譜圖，并得到每份待檢測標準溶液在發射波長為522nm處的熒光強度，以每份待檢測標準溶液的熒光強度為縱坐標，對應待檢測標準溶液的凝血酶濃度為橫坐標作標準曲線，得線性方程。

5.如權利要求2所述的基于酶與氧化石墨烯適配體傳感器檢測凝血酶的方法，其特征在于，升溫至93-97℃后緩慢冷卻至室溫具體為：置于水浴鍋中升溫至93-97℃后，關閉水浴鍋開關，至水浴鍋內水體溫度冷卻至室溫。

6.如權利要求1所述的基于酶與氧化石墨烯適配體傳感器檢測凝血酶的方法，其特征在于，多份待檢測標準溶液中CutSmar緩沖液與待檢測標準溶液的體積比為1:100，每毫升CutSmar緩沖液中包括：50mmol乙酸鉀、20mmol三(羥甲基)氨基甲烷醋酸鹽、10mmol乙酸鎂、及100μg牛血清白蛋白。

7.如權利要求1所述的基于酶與氧化石墨烯適配體傳感器檢測凝血酶的方法，其特征在于，氧化石墨烯分散液在添加前超聲8-12min。

8.如權利要求2所述的基于酶與氧化石墨烯適配體傳感器檢測凝血酶的方法，凝血酶標準溶液、凝血酶適配體DNA溶液、及互補單鏈DNA溶液的溶劑為蒸餾水或Tris-HCl緩沖溶液中的一種。