[發明專利]NK細胞培養基、培養方法及二者的應用

有效

• 申請號: 201710932281.8
• 申請日: 2017-10-09
• 公開（公告）號: CN107446888B
• 公開（公告）日: 2018-11-09
• 發明（設計）人: 徐永勝;牟春琳;王秀娟
• 申請（專利權）人: 天津長和生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 吳開磊

本發明提供了一種NK細胞培養基、培養方法及二者的應用，涉及細胞培養技術領域，本發明提供的一組細胞培養基，包括第一培養基、第二培養基和第三培養基，每種培養基包括無血清基礎培養基和細胞因子。其中，利用無血清基礎培養基可以避免引入外源性物質，降低污染風險，同時，多種細胞因子能夠使NK細胞受到信號刺激，活化NK細胞，促進其大量擴增。本發明提供的細胞培養方法，簡單高效、成本低、短周期內可大量擴增高質量高純度的NK細胞，對于臨床治療至關重要。

技術領域

本發明涉及細胞培養技術領域，尤其是涉及一種NK細胞培養基、培養方法及二者的應用。

背景技術

自然殺傷細胞(Nature Killer cells,NK)是機體固有免疫系統的細胞毒性淋巴細胞，存在于淋巴器官和外周組織中，具有抗腫瘤、抗感染和免疫調節等功能，其無需抗原預先致敏就可以直接識別，并且非特異性地殺傷腫瘤細胞，是人體防御體系的第一道屏障。

NK細胞具有以下特點：1)強大的細胞毒活性，它對刺激因素產生的應答十分迅速，而且免疫應答強度高；2)殺傷活性無需抗原刺激，也不受MHC分子的限制，病毒感染或惡性轉化細胞的MHCⅠ類分子表達下降或消失，借這一機制逃避T細胞識別，但又可能使NK細胞處于失活狀態，從而與T細胞應答互為補充發揮免疫防御功能。3)強大的細胞因子/趨化因子分泌功能，有助于啟動和活化其他免疫細胞(如T細胞、B細胞、樹突狀細胞和內皮細胞等)的應答。

NK細胞抗腫瘤免疫的主要機制包括：1)釋放包含穿孔素和顆粒酶的胞漿顆粒引起靶細胞凋亡，從而清除突變腫瘤細胞；2)死亡受體介導靶細胞凋亡，NK細胞表達至少3種TNF超家族死亡配體：Fas配體(Fas ligand,FasL)、TNF和TNF相關凋亡誘導配體(TNF relatedapoptosis inducing ligand,TRAIL)，通過與腫瘤細胞表面相應死亡受體結合而將其殺傷；3)細胞因子介導的殺傷作用，如INF-γ、TNF、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、IL-5、IL-10、IL-13等；4)發揮抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)主要通過其膜表面低親和力的FcγRⅢ(CD16)介導。

NK細胞在固有免疫和適應性免疫中均發揮重要作用，被認為是腫瘤免疫治療的重要效應細胞。但NK細胞是淋巴細胞中的稀有亞群，在外周血淋巴細胞中約只占10％-20％。正常人體外周血中的NK細胞含量遠不能滿足臨床治療的需要。因此，獲得純度高、擴增效率高、細胞毒性強的NK細胞已成為研究熱點。

目前NK細胞的培養方法主要包括以下幾種：

(1)使用飼養層細胞培養法，如使用病毒轉染的B淋巴細胞或腫瘤細胞，以提高NK細胞擴增倍數；

(2)細胞因子刺激法，單獨使用或組合使用不同細胞因子，刺激外周血單個核細胞，以獲得純度高、擴增效率高、細胞毒性強的NK細胞；

(3)免疫磁珠分選系統陰性分選法，從外周血單個核細胞中獲得少量NK細胞后，應用不同細胞因子組合培養，以獲得純度高、擴增效率高、細胞毒性強的NK細胞；

(4)NK細胞分離試劑盒法，使用商品化試劑盒進行NK細胞培養。

然而，采用病毒轉染的B淋巴細胞及腫瘤細胞作為飼養層細胞以提高NK細胞擴增倍數的方法，生產工藝繁瑣且安全性尚待探討；采用免疫磁珠分選系統陰性分選法進行NK細胞培養，生產成本較高；盡管目前已出現了分離純度可達90％以上的商品化NK細胞分離試劑盒，但因高純度的NK細胞在體外擴增效率很低，尚難滿足大規模實驗以及臨床腫瘤免疫治療的需求。目前大多數NK細胞培養方法均難以同時滿足細胞純度高、細胞毒性強、擴增倍數高等要求。

有鑒于此，特提出本發明。

發明內容