[發(fā)明專利]NK細(xì)胞培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法及二者的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710932281.8
• 申請(qǐng)日: 2017-10-09
• 公開（公告）號(hào): CN107446888B
• 公開（公告）日: 2018-11-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐永勝;牟春琳;王秀娟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津長和生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0783
• 分類號(hào): C12N5/0783
• 代理公司: 北京超凡志成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11371
• 代理人: 吳開磊

1.一種NK細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述NK細(xì)胞的培養(yǎng)方法為如下步驟：

(a)：將濃度為0.6mg/mL的Lymactin-NK抗體包被在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，包被條件為37℃，孵育時(shí)間為2h；

(b)：采集人源外周血，將采集的外周血轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，于20℃溫度下2000rmp，10min離心收集血漿備用；使用淋巴細(xì)胞分離液分離并收集外周血單個(gè)核細(xì)胞，收集后的單個(gè)核細(xì)胞用PBS清洗三次并計(jì)數(shù)，備用；

(c)：取包被好的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，棄去包被液，使用無血清第一基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸步驟(b)提供的外周血單個(gè)核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1.5×10⁶/mL，并接種至包被好的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；

(d)：加入5％自體血漿至培養(yǎng)瓶中，添加第一細(xì)胞因子；

(e)：細(xì)胞培養(yǎng)每3天進(jìn)行補(bǔ)液，使用無血清第二基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×10⁶/mL，補(bǔ)加5％自體血漿及第一細(xì)胞因子；

(f)：細(xì)胞培養(yǎng)至第7天后，每3天進(jìn)行補(bǔ)液，使用無血清第二基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×10⁶/mL，補(bǔ)加第二細(xì)胞因子；

(g)：細(xì)胞培養(yǎng)至第14天，收集細(xì)胞，PBS清洗3次，得到NK細(xì)胞；

其中，所述第一基礎(chǔ)培養(yǎng)基和第二基礎(chǔ)培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基；

所述第一基礎(chǔ)培養(yǎng)基為X-VIVO 15和AlyS505NK-AC；

所述第二基礎(chǔ)培養(yǎng)基為AIM-V；

所述第一細(xì)胞因子為白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-15和白細(xì)胞介素-21；

所述第一細(xì)胞因子的加入量為白細(xì)胞介素-2 1000IU/mL、白細(xì)胞介素-15 20ng/mL和白細(xì)胞介素-21 10ng/mL；

所述第二細(xì)胞因子為白細(xì)胞介素-2和白細(xì)胞介素-15；

所述第二細(xì)胞因子的加入量為白細(xì)胞介素-2 1000IU/mL和白細(xì)胞介素-15 20ng/mL。