[發(fā)明專利]人NOS3基因第74位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710931723.7
• 申請(qǐng)日: 2017-10-09
• 公開（公告）號(hào): CN107475437A
• 公開（公告）日: 2017-12-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王思捷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 王思捷
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及人NOS3基因第74位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性及其與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)性的檢測(cè)；本發(fā)明還涉及該位點(diǎn)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒和方法。

背景技術(shù)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是一種系統(tǒng)性自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)的炎癥為主要特點(diǎn)，主要的病理變化為慢性滑膜炎和血管炎，當(dāng)累及關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)時(shí)，逐漸形成關(guān)節(jié)畸形和強(qiáng)直，導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能喪失。盡管RA的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，但目前普遍認(rèn)為RA的發(fā)生是具備遺傳易感性的個(gè)體在各種危險(xiǎn)因素的刺激下誘導(dǎo)機(jī)體免疫功能紊亂進(jìn)而打破自身免疫耐受所致。迄今為止，研究發(fā)現(xiàn)了幾十個(gè)與RA遺傳易感性相關(guān)的易感區(qū)域/位點(diǎn)，因此RA相關(guān)基因的多態(tài)性特別是占多數(shù)的單核苷酸位點(diǎn)多態(tài)性研究顯得十分重要。然而已報(bào)道的RA相關(guān)基因位點(diǎn)多態(tài)性大多數(shù)是在歐美人群中開展的，亦有在韓國(guó)、日本與北印度等亞洲人群中開展的。不同種族人群間的RA遺傳易感位點(diǎn)既有共同部分也有特異部分。目前尚未見我國(guó)RA單核苷酸多態(tài)性的系統(tǒng)研究。

一氧化氮（nitric oxide, NO）在RA的發(fā)病機(jī)制中起到重要。NO由L-精氨酸胍基末端的氮原子與分子氧在NOS的催化下合成，而NOS是該反應(yīng)唯一的限速酶，NOS3是其中重要的一種。研究表明，NOS3基因與RA、Behcet’s病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、I型糖尿病等多種自身免疫性疾病相關(guān)。Sanger測(cè)序是基因分析的黃金標(biāo)準(zhǔn)，也是基因單核苷酸多態(tài)性分析的重要手段；而實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以對(duì)特定的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，具有靈敏度高、檢測(cè)快速且很好地避免污染的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明通過對(duì)RA家族中NOS3基因第1外顯子片段的Sanger測(cè)序分析，新發(fā)現(xiàn)了其第74位點(diǎn)的特定單核苷酸多態(tài)性尚未見報(bào)道，并通過構(gòu)建的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法在人群樣本中進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有中國(guó)人群類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的易感基因多態(tài)性位點(diǎn)缺乏解析的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供人NOS3基因特定位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性，本發(fā)明的另一目的在于提供人NOS3基因第74位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)試劑盒和方法。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為，人NOS3基因第74位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性，其特征在于第74位點(diǎn)的單核苷酸為C核苷酸或A核苷酸即74C/A，其中健康人群NOS3基因第74位點(diǎn)均為C核苷酸，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎人群NOS3基因第74位點(diǎn)為A核苷酸的比例高達(dá)21%，兩者具有顯著性的人群分布差異；NOS3基因第74位點(diǎn)為A核苷酸其所在片段對(duì)應(yīng)的序列如SEQ ID NO.1所示，第74位點(diǎn)為C核苷酸其所在片段對(duì)應(yīng)的序列如SEQ ID NO.2所示。需要指出的是由于是DNA序列，本發(fā)明的的C或C核苷酸指的是胞嘧啶脫氧核糖核苷酸，A或A核苷酸指的是腺嘌呤脫氧核糖核苷酸。

本發(fā)明提供的人NOS3基因第74位點(diǎn)的C/A核苷酸多態(tài)性檢測(cè)試劑盒為實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，可以用于檢測(cè)人NOS3基因第74位點(diǎn)的C核苷酸或A核苷酸中的至少一個(gè)，該試劑盒包含特異性設(shè)計(jì)的上下游引物和兩種TaqMan探針，其中上下游引物P1和P2序列分別如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，兩種TaqMan探針T1和T2序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，分別對(duì)應(yīng)NOS3基因第74位點(diǎn)的C和A核苷酸,其中T1探針其5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，而T2探針其5’端標(biāo)記HEX熒光基團(tuán)，此兩種探針3’端均標(biāo)記TAMRA熒光淬滅基團(tuán)。此外，本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒還包括定量PCR預(yù)混液，是預(yù)先混合好了的定量PCR緩沖液、dNTP混合液和耐熱DNA聚合酶的混合液，可向商業(yè)化生物公司購買。

對(duì)應(yīng)于本發(fā)明提供的人NOS3基因第74位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)試劑盒，本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法其體系為：2×定量PCR預(yù)混液10.0μL，上下游引物P1和P2的終濃度均為1μmol/L，TaqMan探針T1和T2的終濃度均為1.5μmol/L，基因組DNA終濃度不少于10ng/μL，滅菌蒸餾水補(bǔ)足至反應(yīng)總體積為20μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)條件為：95℃預(yù)變性3min，再95℃變性15s，57℃退火及延伸40s，循環(huán)50次。

本發(fā)明提供了人 NOS3基因第74位點(diǎn)的C/A核苷酸多態(tài)性，并揭示了其與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎易感性的關(guān)聯(lián)，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建其快速特異實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)試劑盒和方法，這些可以為中國(guó)人群類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的易感性機(jī)制解析、易感基因檢測(cè)和精準(zhǔn)診治提供基礎(chǔ)。

附圖說明