[發明專利]一種檢測轉基因油菜轉化載體的五重PCR引物及方法

在審

• 申請號: 201710930202.X
• 申請日: 2017-10-09
• 公開（公告）號: CN107513573A
• 公開（公告）日: 2017-12-26
• 發明（設計）人: 修偉明;魯軍;李剛;趙建寧;楊殿林
• 申請（專利權）人: 農業部環境保護科研監測所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司11246
• 代理人: 夏艷

技術領域

本發明屬于轉基因檢測技術領域，尤其涉及一種檢測轉基因油菜轉化載體的五重PCR引物及方法。

背景技術

目前常用的轉基因檢測技術分為兩大類，一類是檢測外源基因，一類是檢測外源基因表達的蛋白質產物。由于核酸，尤其是DNA的穩定性較高，加工過程當中不容易被降解，所以核酸檢測技術在轉基因成分檢測中應用最為廣泛。隨著轉基因植物和產品的不斷增加，其外源基因成分也越來越復雜，傳統的PCR檢測技術已經不能滿足可同時檢測多基因多品種的要求。因此迫切需要可同時檢測多個轉基因成分的檢測方法。多重PCR(Multiplex PCR)是在普通PCR的基礎上加以改進，于一個PCR反應體系中加入多對特異性引物，針對多個DNA模板或同一模板的不同區域擴增多個目的片段的PCR技術。與單重檢測方法相比多重檢測具有成本低、通量高、節省實驗樣品和藥品等優點。多重PCR檢測技術已經廣泛應用于不同行業之中。對于轉基因植物檢測來講，目前主要針對轉基因植物外源插入的通用元件和目的基因進行多重PCR檢測，但相較于轉化載體特異性檢測來講其特異性較差。轉化載體特異性檢測因為其檢測的目的片段是外源插入基因和宿主DNA之間連接區域，故比單純基因特異性檢測和構建特異性檢測具有更高的特異性。傳統單重轉基因植物轉化載體特異性PCR檢測方法已經廣泛應用于轉基因植物身份識別和驗證檢測過程中。但多重轉基因植物轉化載體特異性PCR檢測方法非常少，不能滿足轉基因植物和產品的不斷增加，其外源基因成分也越來越復雜的檢測要求。根據農業部官方網站信息，目前有9個轉基因油菜品種，分別為孟山都公司的GT73(RT73)和拜爾公司的MS1×RF1、MS1×RF2、MS8×RF3、OXY235、T45和Topas19/2已在我國通過環境安全評估并獲得作為加工原料進口的許可。由于轉基因油菜開始頻繁地進入我國，轉基因油菜的環境安全和食用安全性問題引起人們關注。為進一步加強轉基因油菜監管，開發更有效轉基因油菜檢測和監測等技術平臺的建設就勢在必行。

綜上所述，現有技術存在的問題是：現有的轉基因生物檢測標準化方法主要集中在單一調控元件、單個目標基因、單個轉化事件的PCR檢測上，通量低、費時費力、試劑消耗大。隨著轉基因植物和產品的不斷增加，其外源基因成分也越來越復雜，勢必將向通量高、精準、簡捷方便的多重檢測方向發展。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種檢測轉基因油菜轉化載體的五重PCR引物及方法。

本發明是通過重新設計以及篩選現有轉基因油菜轉化載體單重PCR引物，隨后對選定引物進行優化組合后實現的，一種檢測轉基因油菜轉化載體的五重PCR引物，所述檢測轉基因油菜轉化載體的五重PCR引物的序列為：SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：10。

本發明的另一目的在于提供一種利用所述檢測轉基因油菜轉化載體的五重PCR引物的檢測轉基因油菜轉化載體的五重PCR的檢測方法，所述檢測轉基因油菜轉化載體的五重PCR的檢測方法包括以下步驟：

步驟一，合成引物；

步驟二，制備檢測樣品的DNA模板；

步驟三，配制PCR反應體系；

步驟四，進行PCR反應；

步驟五，取PCR反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳。

進一步，所述步驟三中各引物加入終濃度分別為：CruA-F/R 0.1μM,T45-F/R 1.2μM,GT73-F/R 0.6μM,RF2-F/R 4μM,RF3-F/R 0.3μM。DNA模板終濃度為2ng/μL。

進一步，所述步驟二中DNA濃度為100ng/μL。

進一步，所述步驟四中PCR反應條件為：94℃變性5min；進行40次循環擴增反應，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸5min；引物退火溫度為58℃。

本發明的優點及積極效果為：傳統PCR鑒定一個轉基因油菜品系就要分別進行油菜內參基因和相應的轉化載體反應，而本發明在一次PCR反應中即可同時檢測出油菜內標準基因和四種轉基因油菜品系，具有非常顯著的省時、省力、節省珍貴的實驗樣品和藥品等優勢。本發明采用瓊脂糖凝膠電泳進行結果分析，瓊脂糖凝膠電泳簡單、經濟，不需要昂貴的儀器設備，而且只需要一次電泳分析即可得知是否含有上述四種轉基因油菜。

附圖說明