[發明專利]一種固定化酶催化合成NADPH的方法

有效

• 申請號: 201710929892.7
• 申請日: 2017-10-09
• 公開（公告）號: CN107557412B
• 公開（公告）日: 2020-02-28
• 發明（設計）人: 秦正紅
• 申請（專利權）人: 蘇州人本藥業有限公司
• 主分類號: C12P19/36
• 分類號: C12P19/36;C12N11/00
• 代理公司: 北京三聚陽光知識產權代理有限公司 11250
• 代理人: 張倩倩

本發明公開了一種固定化酶催化合成NADPH的方法，包括以下步驟：(1)在二價金屬離子存在下，以NAD和偏磷酸鹽為底物配制成第一反應液，向第一反應液中加入固定化NAD激酶，催化合成NADP；(2)去除第一反應液中的固定化NAD激酶，繼續加入葡萄糖配制成第二反應液，向第二反應液中加入固定化葡萄糖脫氫酶，催化合成NADPH。上述方法實現了以連續反應合成NADPH，生產工藝簡單，生產周期短，生產成本低，產品質量更加穩定；另一方面，采用固定化酶催化制備NADPH，固定化酶能夠連續、反復多次使用，進一步降低了生產成本，避免了產物中引入蛋白雜質，固定化酶應用于上述方法中有利于生產高純度和高收率的NADPH。

技術領域

本發明屬于生物制藥領域，具體涉及一種固定化酶催化合成NADPH的方法。

背景技術

還原型輔酶II(triphosphopyridine nucleotide，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，簡稱：NADPH)是一種極為重要的核苷酸類輔酶，它是氧化型輔酶I(NicotinamideAdenine Dinucleotide，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，簡稱：NAD)中與腺嘌呤相連的核糖環系2’-位的磷酸化衍生物。NADPH作為細胞內最為重要的電子供體和生物合成的還原劑，可為還原性生物合成提供氫離子，參與如氨基酸、脂肪酸、膽固醇、單加氧酶系、類固醇激素等生物分子的合成。NADPH除了參與生物合成，還參與體內羥化反應和藥物、毒物及某些激素的生物轉化。例如，NADPH可利用解毒細胞的電子供體，通過體內代謝減少生物體氧化型化合物，維持其氧化還原的平衡，在氧化防御系統發揮重要作用。NADPH也可以借助于異檸檬酸穿梭作用進入呼吸鏈產生ATP:由于線粒體內膜對物質的通透性很低，線粒體外產生的NADPH不能直接進入呼吸鏈被氧化。NADPH上的Η可以在異檸檬酸脫氫酶的作用下被交給NAD+，然后由NAD+進入呼吸鏈產生能量。NADPH還是谷胱甘肽(GSH)的還原酶的輔酶，可使氧化型谷胱甘肽(GSSG)生成還原型GSH，維持還原型的GSH的正常含量。GSH是細胞內重要的抗氧化劑，可保護一些含巰基的蛋白質、脂肪和蛋白酶類免受氧化劑的破壞，特別在維持紅細胞膜的完整性方面起著重要作用。目前，基于NADPH的多重生理功能，已有文獻報道NADPH作為制備防治腦缺血性中風、心臟疾病，以及抗疲勞藥物的應用。隨著NADPH在醫藥行業及保健品行業越來越廣泛的應用，對生產NADPH方法的研究具有重大的理論意義和經濟意義。

NADPH是NADP+的還原形式，目前NADP+的合成方法可以分為化學法和生物法，化學法以煙酰胺為原料，經多步反應合成出NADP+，化學法存在反應路線長，反應條件苛刻，選擇性差，易生成副產物，產物純度低，收率低，需用到昂貴的試劑，成本較高等不足；此外，大量有機溶劑的使用還會造成環境污染。因此，該工藝路線不適合于工業化大生產(JamesDowden et al,Chemical Synthesis of the Second Messenger Nicotinic AcidAdenine Dinucleotide Phosphate by Total Synthesis of Nicotinamide AdenineDinucleotide Phosphate,Angew.Chem.Int.Ed.2004,43:4637-4640)。傳統的生物法是采用發酵或其它微生物培養技術,并通過對酵母或其它微生物的分離提取得到NADP+。該工藝過程雖然已很成熟，但是原料耗費巨大，勞動強度大，能源消耗大，產量有限，生產成本高，產品價格高，限制了氧化型輔酶II(NADP+)的廣泛應用(Sakai.T,Biotech.Bioeng.1980,22,Suppl.1,143-162；Uchida，T.etal,Agric.Biol.Chem.1971,37,1049-1056；Sakai,T.and Uchida，T.et al,Agric.Biol.Chem.1973,37,1041-1048)。