[發明專利]一種固定化酶催化合成NADPH的方法

有效

• 申請號: 201710929892.7
• 申請日: 2017-10-09
• 公開（公告）號: CN107557412B
• 公開（公告）日: 2020-02-28
• 發明（設計）人: 秦正紅
• 申請（專利權）人: 蘇州人本藥業有限公司
• 主分類號: C12P19/36
• 分類號: C12P19/36;C12N11/00
• 代理公司: 北京三聚陽光知識產權代理有限公司 11250
• 代理人: 張倩倩

1.一種固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）在二價金屬離子存在下，以NAD和偏磷酸鹽為底物配制成第一反應液，向所述第一反應液中加入固定化NAD激酶，催化合成NADP；

（2）濾除所述第一反應液中的固定化NAD激酶，加入葡萄糖配制成第二反應液，向所述第二反應液中加入固定化葡萄糖脫氫酶，催化合成NADPH。

2.根據權利要求1所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，所述二價金屬離子為鎂離子，所述NAD、所述偏磷酸鹽和所述鎂離子以1：（1~20）：（0.025~2.5）的質量比混和于溶劑中，所述溶劑與所述NAD的質量比為（10~100）：1，形成所述第一反應液。

3.根據權利要求1或2所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，所述固定化NAD激酶與所述NAD的質量比為（1~20）：1。

4.根據權利要求1或2所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，所述NADP合成的反應條件為：調節pH為4~8，在25℃~55℃的溫度下反應10~40小時。

5.根據權利要求1所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，按照所述葡萄糖與所述NAD的摩爾比為（0.1~5）：1加入所述葡萄糖后，補充加入溶劑，至所述溶劑與所述NAD的質量比為（10~100）：1，形成所述第二反應液。

6.根據權利要求1或5所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，所述固定化葡萄糖脫氫酶與所述NAD的質量比為（0.1~5）：1。

7.根據權利要求1或2或5所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，所述NADPH合成的反應條件為：調節pH為6~9，在5℃~35℃的溫度下反應至pH保持穩定。

8.根據權利要求2或5所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，所述溶劑為純化水或包括磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀和磷酸二氫鈉中至少一種的水溶液。

9.根據權利要求1或2或5所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，還包括將所述NAD激酶和葡萄糖脫氫酶固定化的方法：

a. 將酶載體用質量濃度為1-3%的戊二醛活化后過濾，作為固定化載體；

b. 分別將固定化載體加入NAD激酶和葡萄糖脫氫酶的酶液中，調節pH為5~9，在10℃~30℃下緩慢攪動，固定18~36小時得到固定化NAD激酶和固定化葡萄糖脫氫酶。

10.根據權利要求9所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，所述NAD激酶與所述酶載體的質量為比1:5，所述葡萄糖脫氫酶與所述酶載體的質量為比1:5。

11.根據權利要求9所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，固定所述NAD激酶的酶載體為LX-1000HFA，固定所述葡萄糖脫氫酶的酶載體為LX-1000NH。

12.根據權利要求9所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，還包括NAD激酶和葡萄糖脫氫酶的制備方法：

1）分別發酵培養所述NAD激酶的生產菌和所述葡萄糖脫氫酶的生產菌，發酵結束后收集菌體，將收集的菌體破碎后得到NAD激酶的粗酶液和葡萄糖脫氫酶的粗酶液；

2）將步驟1）中得到的粗酶液進行絮凝，然后過濾所述粗酶液，得到純化的NAD激酶的酶液和葡萄糖脫氫酶的酶液。

13. 根據權利要求12所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，所述NAD激酶的生產菌為克隆有SEQ ID NO.1所示基因的大腸桿菌基因工程菌，所述葡萄糖脫氫酶的生產菌為克隆有SEQ ID NO.2所示基因的大腸桿菌基因工程菌。