[發明專利]一種生物酶催化制備硝苯基二醇的方法

在審

• 申請號: 201710926775.5
• 申請日: 2017-10-08
• 公開（公告）號: CN107418983A
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發明（設計）人: 趙媛媛;畢康平;李丹;張雪健
• 申請（專利權）人: 青島科技大學
• 主分類號: C12P13/00
• 分類號: C12P13/00;C12N9/08
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種生物酶催化制備硝苯基二醇的方法，其特征在于用豆莢過氧化物酶催化制備2-氯-4-甲氧基-6-硝基苯-1,3-二醇，底物為2-氯-4-甲氧基苯-1,3-二醇，生產的目標產物為2-氯-4-甲氧基-6-硝基苯-1,3-二醇，反應介質為水-乙酸乙酯，其中水相為pH6.7的磷酸鹽緩沖液，水相：乙酸乙酯=80:20，將底物溶入乙酸乙酯，然后加入反應器，反應溫度50-52℃，反應時間為8.4-9.2h，豆莢過氧化物酶濃度為4-5mU/ml，底物濃度為30mM，NaNO₂濃度為350mM，H₂O₂采用流加的加料方式，反應開始時，加入H₂O₂，使其濃度為8.5mM，啟動酶催化反應；然后開始流加，用蠕動泵加入H₂O₂，使濃度維持在7.5-9.5mM；反應結束后，得到目標產物，用環己烷萃取3次，合并有機相，減壓蒸出有機溶劑，得到產物；底物轉化率為88.1-89.4%，目標產物產率為71.4-71.8%。

2.權利要求1所述的方法，其特征在于所述豆莢過氧化物酶的提取方法為：

新鮮大豆莢用粉碎機粉碎后，粒度小于1mm，加5倍大豆莢質量的去離子水室溫下浸泡4小時，過濾浸泡液，得到初提液，初提液體積V；攪拌中對初提液加入固體硫酸銨，使成45%飽和度，此時體積為V1；繼續攪拌中再加入0.3V的預冷丙酮，經5000rpm，10分鐘離心，得到上清液1，對上清液1加入固體硫酸銨，按V1體積計算加到75%飽和度，經5000rpm，10分鐘離心；此時，在水相與丙酮相界面處將形成一層沉淀，即沉淀1，取沉淀1，加入沉淀1體積5倍的去離子水溶解沉淀1，超濾脫鹽后，經5000rpm，10分鐘離心，得到上清液2，上清液2體積V2，取上清液2，用丙酮分級沉淀：對上清液2先加1.0V2體積預冷丙酮，經5000rpm，10分鐘離心，得到上清液3，對上清液3再加0.8V2體積丙酮，經5000rpm，10分鐘離心，得到沉淀2；減壓抽干沉淀2中的丙酮，加10倍沉淀2體積的去離子水溶解沉淀2，調pH到8.0，加1mol/L硫酸鋅，使硫酸鋅成0.01mol/L終濃度，經5000rpm，10分鐘離心，得上清液4；將上清液4調pH至7，用超濾脫鹽濃縮，冷凍干燥，得到豆莢過氧化物酶粉，酶活為30-40U/mg；

用干豆莢也可提取豆莢過氧化物酶，方法如下：干大豆莢，加12倍干大豆莢質量的去離子水浸泡1小時，用粉碎機粉碎后，4℃浸泡過夜，將浸泡液過濾后，得到初提液，初提液體積V；其余步驟同鮮豆莢。