[發明專利]一種生物酶催化制備硝苯基二醇的方法

在審

• 申請號: 201710926775.5
• 申請日: 2017-10-08
• 公開（公告）號: CN107418983A
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發明（設計）人: 趙媛媛;畢康平;李丹;張雪健
• 申請（專利權）人: 青島科技大學
• 主分類號: C12P13/00
• 分類號: C12P13/00;C12N9/08
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于化工技術領域，特別涉及到使用豆莢過氧化物酶催化制備精細化工中間體2-氯-4-甲氧基-6-硝基苯-1,3-二醇的技術。

背景技術

2-氯-4-甲氧基-6-硝基苯-1,3-二醇是一種重要的精細化工中間體，用傳統的化學工藝生產該產品，將產生大量的廢酸和含有有機物的酸性廢水而導致環境污染嚴重，而且所得產物幾乎沒有選擇性而產生原材料的浪費。現有工藝無法避免強酸所造成設備的腐燭及反應過程中發生多氧化等副產物對反應帶來的安全隱患等問題。該類化合物產品生產的資源消耗要遠遠高于大噸位基礎化工產品，各類環境污染安全生產事故更是頻繁發生 這一現狀嚴重制約了整個產業的可持續發展。做到綠色環保、清潔生產對于企業來說不再是錦上添花，而是關乎生死的一件大事。

因此該類產品生產工藝的研究，特別是開發新的生產路線的研究，一直相當活躍，主要圍繞著提高產物的選擇性和改善反應的環境，減少反應所引起的環境污染。

生物酶催化反應具有環境友好、選擇性好的特點，目前尚未見用生物酶催化合成該產品的報道。如果能將生物酶用于催化生產該產品，則可能大幅度提高產物的選擇性，消除傳統反應所引起的環境污染，實現綠色生產該產品。

過氧化物酶是氧化還原酶類一種，是一個大家族，包括辣根過氧化物酶、乳過氧化物酶、髓過化氧物酶、微生物過氧化物酶(如氯過氧化物酶)、大豆過氧化物酶等等，被用于催化許多化學反應，可催化H₂O₂與多種有機、無機氫供體發生氧化還原反應，例如脫甲基反應、環氧化反應、聚合反應、偶聯反應等。

大豆過氧化物酶，一般是指豆殼過氧化物酶，即由大豆種皮提取的過氧化物酶。實際上，大豆豆莢也含有過氧化物酶，從大豆莢提取的過氧化物酶稱之為大豆莢過氧化物酶，或簡稱為豆莢過氧化物酶。由于豆莢的量多于豆皮，所以，豆莢過氧化物酶的量更大。我們的實驗表明，豆殼過氧化物酶與豆莢過氧化物酶在催化反應中，也存在較大的差別。

發明內容

在H₂O,，NaNO₂存在下，采用豆莢過氧化物酶催化底物（1），即2-氯-4-甲氧基苯-1,3-二醇,反應生成（2），即2-氯-4-甲氧基-6-硝基苯-1,3-二醇，具體反應式如下：

考慮到多種過氧化物酶都可能催化底物，得到我們的目標產物，所以，我們用多種過氧化物酶進行了催化反應實驗，以選擇最佳的過氧化物酶，所用的酶包括辣根過氧化物酶、乳過氧化物酶、氯過氧化物酶(來自海洋真菌 Caldariomyces fumago)、大豆殼過氧化物酶、豆莢過氧化物酶等。其中辣根過氧化物酶、乳過氧化物酶、氯過氧化物酶(來自海洋真菌 Caldariomyces fumago)、大豆殼過氧化物均可由市場購得，而豆莢過氧化物酶市場沒有商品出售，由我們自己從大豆莢提取。

從大豆莢提取豆莢過氧化物酶的分離純化工藝如下。

經過大量實驗研究，得到優化的豆莢過氧化物酶分離純化新工藝。新鮮大豆莢10kg用粉碎機粉碎后，粒度小于1mm，加50L去離子水室溫下浸泡4小時，浸泡液過濾后，得到初提液，初提液體積V；攪拌中對初提液加入固體硫酸銨，使成45%飽和度，此時體積為V1；繼續攪拌中再加入0.3V的預冷丙酮，經5000rpm，10分鐘離心，得到上清液1，對上清液1加固體硫酸銨，按V1體積計算到75%飽和度，經5000rpm，10分鐘離心；此時，在水相與丙酮相界面處將形成一層沉淀，即沉淀1，取沉淀1，加入沉淀1體積5倍的去離子水溶解沉淀1，超濾脫鹽后，經5000rpm，10分鐘離心，得到上清液2，上清液2體積V2，取上清液2，用丙酮分級沉淀：對上清液2先加1.0V2體積丙酮，經5000rpm，10分鐘離心，得到上清液3，對上清液3再加0.8V2體積丙酮，經5000rpm，10分鐘離心，得到沉淀2。減壓抽干沉淀2中的丙酮，加10倍沉淀2體積的去離子水溶解沉淀2，調pH到8.0，加1mol/L硫酸鋅，使硫酸鋅成0.01mol/L終濃度，經5000rpm，10分鐘離心，離心后得上清液4；將上清液4調pH至7，用超濾脫鹽濃縮，冷凍干燥，得到豆莢過氧化物酶粉，酶活為30-40U/mg。

用干豆莢也可提取豆莢過氧化物酶，方法如下。干大豆莢10Kg，加120L去離子水浸泡1小時，用粉碎機粉碎后，4℃浸泡過夜，浸泡液過濾后，得到初提液體積V。其余步驟同鮮豆莢，不再贅述。

使用分光光度法測定豆莢過氧化物酶的酶活性。