[發明專利]一種提高大麥組培快速成苗的方法

有效

• 申請號: 201710926732.7
• 申請日: 2017-10-08
• 公開（公告）號: CN107646681B
• 公開（公告）日: 2019-12-06
• 發明（設計）人: 沈秋芳;吳德志;葉玲珍;傅良波;張國平
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/00;A01H4/00
• 代理公司: 33304 杭州永航聯科專利代理有限公司
• 代理人: 侯蘭玉<國際申請>=<國際公布>=<進入

本發明提供一種提高大麥組培快速成苗的方法，步驟如下：1）選擇直徑大小為1?3cm的大麥幼胚，分別用酒精和次氯酸鈉表面消毒，降低雜菌污染率；2）準確分離幼胚胚芽鞘，對盾片進行二次處理，誘導愈傷組織快速發生；3）根據幼胚的大小調整預培養和農桿菌侵染的時間，預防菌液過量；4）采用弱光遮蔽法提高綠點分化率和成苗率；5）調整愈傷誘導培養基、分化培養基和生根培養基的抗生素配比和使用時間，誘導愈傷組織快速成苗。本發明為大麥幼胚的組培方法，愈傷發生快，胚性愈傷多，可操作性強，綠點分化和成苗率高，不限于材料基因型的限制；建立的大麥幼胚轉化再生體系，可為探索大麥遺傳改良和細胞工程育種研究提供技術支撐。

技術領域

本發明屬于植物基因工程技術領域，特別涉及一種提高大麥組培快速成苗的方法。

背景技術

當前，國際大麥測序聯盟組裝完成了高質量的大麥參考基因組序列，為進一步拓寬栽培大麥基因庫提供了應對策略(Mascher et al.,2017,Nature.544(7651):427-433)。作為二倍體禾本科小麥族作物，大麥是國際上公認的植物遺傳研究理想的模式材料(Mayeret al.,2012,Nature.491(7426):711-716)。目前，大麥轉基因技術普遍采用農桿菌介導的大麥幼胚遺傳轉化方法，相比于基因槍法具有轉化效率高、遺傳穩定等優勢；但該方法對材料的基因型依賴性強，轉化成苗周期較長，目前僅限于歐洲栽培品種Golden Promise等少數栽培大麥品種(Wan and Lemaux,1994,Plant Physiol.104:37-48；Tingay et al.,1997,Plant J.11:1369-1376)，難以滿足廣泛的商業化應用和基礎研究等的需求。在日益增長的基因功能研究和育種進程中，迫切需要一種更高效、更廣泛、更快速的大麥組培轉基因技術。

大麥幼胚仍是目前使用最廣泛、最有效的遺傳轉化外植體，也有一些基于花藥、成熟胚和葉基等作為轉化材料的報道，但其可操作性和轉化效率仍不如幼胚(Zhang et al.,2001,Plant J.28(4):431-441；Han et al.,2011,J Zhejiang Univ-Sci B.12(5):399-407；Yang et al.,2012,CN102577946A[P]；Liao et al.,2013,CN103421837A[P])。Bartlett等人(2008,Plant Methods.4:22)提出了一種農桿菌轉化大麥幼胚的方法，通過在誘導培養基中添加Cu²⁺有效地促進了愈傷的增殖，并將Golden Promise的轉化率提高到25％。但在應用實例中，受限于大麥幼胚的大小和狀態，經常出現愈傷組織增長緩慢、農桿菌侵染過量難以抑制、在轉移或分化培養基中綠點難以分化成苗等問題，實際成功轉化一個基因所需的幼胚初始數量甚至可達上千(Zi,Hangzhou:Zhejiang University,2015)。此外，Golden Promise是上世紀六十年代培育的歐洲栽培大麥(Pakniyat et al.,1997,Plant Breeding.116:189-191)，其產量、品質和抗病等農藝性狀表現遠低于現有的各國主栽品種。因此，基于農桿菌介導的大麥遺傳轉化體系的構建需要加快愈傷增殖、提高成苗率和切實解決基因型依賴性等問題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種提高大麥組培快速成苗的方法，該方法是采用農桿菌介導的大麥幼胚轉化的技術方法，能加快愈傷生成速率，縮短組培成苗所需時間，并可高效而普遍地應用于大麥不同基因型的遺傳改良和基因功能研究。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：

1)大麥幼胚材料的選擇和滅菌：選擇直徑大小為1-3cm的大麥幼胚，分別用酒精和次氯酸鈉表面消毒，降低雜菌污染率；

2)幼胚快速分離與愈傷增殖：準確分離幼胚和胚芽鞘，對盾片進行二次處理，誘導愈傷組織快速發生；

3)農桿菌侵染與篩選培養：根據幼胚的大小調整預培養和農桿菌侵染的時間，預防菌液過量；