[發明專利]一種提高大麥組培快速成苗的方法

有效

• 申請號: 201710926732.7
• 申請日: 2017-10-08
• 公開（公告）號: CN107646681B
• 公開（公告）日: 2019-12-06
• 發明（設計）人: 沈秋芳;吳德志;葉玲珍;傅良波;張國平
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/00;A01H4/00
• 代理公司: 33304 杭州永航聯科專利代理有限公司
• 代理人: 侯蘭玉<國際申請>=<國際公布>=<進入

1.一種提高大麥組培快速成苗的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

（1）大麥幼胚材料的選擇和滅菌：選擇未成熟胚飽滿、胚乳膠狀，半透明、直徑大小為1-3cm的大麥幼胚，摘除麥芒保持幼胚種皮完整，依次用酒精滅菌，再用現配的次氯酸鈉溶液靜置，滅菌水反復清洗，晾干；

（2）幼胚快速準確分離與愈傷誘導：

取步驟（1）中滅過菌的幼胚于墊有雙層無菌濾紙的培養皿蓋上，背部朝上，麥芒末段遠離操作者；

利用雙鑷子尖端夾擊法，左手鑷子尖端刺穿1/2胚乳處并始終固定住幼胚，右手鑷子尖端撕扯下破損種皮，露出至少1/2幼胚；

找準胚芽鞘與盾片縫隙部位，右手鑷子一側尖端勾住胚芽鞘往里往下剝離，切斷在盾片底部凸起部位；

在盾片中央用鑷子尖端輕劃幾下造成傷口，取出完整盾片后將其正面輕撫接觸誘導培養基，最后盾片正面朝上放入誘導培養基，每皿放60-80個盾片；

如需經農桿菌侵染以獲得轉基因苗，則按步驟（3）操作；

如直接用于愈傷組織誘導，則23℃黑暗培養4-5周，每兩周更換一次不含潮霉素和特泯菌的誘導培養基，而后轉到步驟（4）；

（3）農桿菌侵染與篩選培養：

按盾片直徑d大小依次放入若干誘導培養基，22℃黑暗環境，d≥3 mm 時預培養為0 d、3 mm >d≥2 mm 為1 d、2 mm >d≥1 mm 為2 d、d＜1 mm 為3 d；

使用100 μL移液槍吸取農桿菌菌液逐個滴加在盾片中央侵染愈傷，其后立即吸回多余菌液，將盾片換至新的誘導培養基；

共培養2-3 d后，減少愈傷數目至每皿30-40個，更換兩輪誘導篩選培養基，暗培養20-30 d；

（4）愈傷的分化、成苗和煉苗：

自愈傷起，生根前的分化階段全程用單層A4紙遮蓋培養皿蓋，每張A4紙遮蓋6個培養皿，營造弱光環境；

先取步驟（2）或（3）中淡黃致密的愈傷塊，每皿15個單獨的愈傷塊，置于轉移或轉移篩選培養基中培養兩周；

再在轉移至分化或分化篩選培養基前，剔除顏色發白和褐化的部分，挑選有綠點分化的愈傷塊轉入分化或分化篩選培養基中繼續培養2-4周；

待綠點成苗后，長至2-3cm時，將其轉移到含生根或生根篩選培養基的12 ml培養管中，培養2-4周后根系建成；

煉苗時即開蓋，加滅菌水至高出液面1-2cm，在外界環境適應2-3 d，洗凈根周圍的培養基，先在1/2大麥水培營養液中培養1周，再移至營養土中，在適宜條件下培養至收獲種子；

若為轉化后的愈傷分化與成苗，步驟如上所述，培養基則為轉移篩選培養基、分化篩選培養基和生根篩選培養基；

以1L計，步驟（2）-（4）所述的各培養基組分如下，其中在農桿菌轉化條件下在分化階段逐漸減少抗生素的使用量，除植物凝膠高壓滅菌，其余成分均過濾滅菌：

a.誘導培養基：4.3 g MS基礎培養基 + 30 g麥芽糖 + 1.0 g干酪素水解物 + 350 mg肌醇 + 690 mg脯氨酸 + 1.0 mg鹽酸硫胺 +1.25 mg CuSO₄·5H₂O + 2.5 mg麥草畏 + 3.5g植物凝膠，1 M NaOH調至pH=5.8；

誘導篩選培養基：a中誘導培養基 + 50 mg潮霉素 + 160 mg特泯菌；

b.轉移培養基：2.7 g不含硝酸銨的MS培養基+ 20 g麥芽糖 + 165 mg 硝酸銨+ 750mg谷氨酰胺 + 100 mg肌醇 + 0.4 mg鹽酸硫胺 + 1.25 mg CuSO₄·5H₂O + 2.5 mg 2,4-D+ 0.1 mg 6-BA+ 3.5 g植物凝膠，1 M NaOH調至pH=5.8；

轉移篩選培養基：b中轉移培養基 + 40 mg潮霉素 + 120 mg特泯菌；

c.分化培養基：MS微量元素+ N6大量元素+ N6 鐵鹽+ B5有機成分+ 30 g麥芽糖 +100 mg肌醇 + 690 mg脯氨酸 + 0.1 mg 2,4-D + 1.0 mg 6-BA +3.5 g植物凝膠，1 MNaOH調至pH=5.8；

其中MS微量元素的組成是22.3 mg MnSO₄·H₂O + 8.6 mg ZnSO₄·7H₂O + 6.2 mgH₃BO₃ + 0.25 mg Na₂MoO₄·H₂O +0.025 mg CuSO₄·5H₂O + 0.025 mg CoCl₂·6H₂O +0.83mg KI，N6大量元素的組成是2.8 g KNO₃+ 0.46 g (NH₄)₂SO₄ + 0.4 g KH₂PO₄ + 185 mgMgSO₄·7H₂O + 165 mg CaCl₂·2H₂O，N6 鐵鹽的組成是37.3 mg Na₂·EDTA·2H₂O + 27.8mg FeSO₄·7H₂O，B5有機成分的組成是1.0 mg 維生素B1 + 0.5mg 維生素B6 + 2 mg 甘氨酸 + 0.5 mg 煙酸；

分化篩選培養基：c中分化培養基 + 30 mg潮霉素 + 80 mg特泯菌；

d.生根培養基：4.3 g MS基礎培養基 + 25 g麥芽糖 + 1.0 g干酪素水解物 + 350 mg肌醇 + 690 mg脯氨酸 + 1.0 mg鹽酸硫胺 + 3.2 g植物凝膠，1 M NaOH調至pH=5.8；

生根篩選培養基：d中生根培養基 + 20 mg潮霉素 + 40 mg特泯菌。