[發明專利]一種莖尖玻璃化超低溫脫除蘋果病毒的方法

有效

• 申請號: 201710920265.7
• 申請日: 2017-09-30
• 公開（公告）號: CN107667857B
• 公開（公告）日: 2020-12-01
• 發明（設計）人: 高志紅;李艷林;渠慎春;欒雨婷
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;李曉峰

1.一種莖尖玻璃化超低溫脫除蘋果病毒的方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）攜帶病毒無菌組培苗的獲得：將經過檢測含病毒的蘋果材料進行初代培養，獲得無菌組培苗；

（2）繼代擴繁培養：對所述的無菌組培苗進行繼代擴繁培養；

（3）莖尖玻璃化超低溫處理脫毒：取繼代擴繁培養后的組培苗，切取莖尖，接種于預培養基上進行預培養；將預培養過的莖尖放在裝載溶液中，20~25℃條件下裝載30~60min；然后轉至PVS-2溶液中，0~2℃下進行90~120min PVS-2玻璃化處理；然后進行液氮冷凍處理；最后進行水浴解凍處理；將解凍處理后的莖尖放入MS+1.2 mol/L的蔗糖溶液中浸泡處理；

（4）后期增殖擴繁培養：將玻璃化超低溫處理后的莖尖接種在莖尖再生培養基上暗培養后轉為光照培養，最后將再生植株進行繼代擴繁；

步驟（1）中所述初代培養所用的初代培養基配方為：MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+500mg/L PVP+30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂粉，pH=5.8；

步驟（2）中所述繼代擴繁培養所用的繼代擴繁培養基配方為：MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉，pH=5.8；

步驟（4）中所述莖尖再生培養基的配方為：MS + 0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+500mg/LPVP+30g/L蔗糖+5.5 g/L 瓊脂，pH=5.8；將再生植株進行繼代擴繁所用的繼代擴繁培養基為：MS + 0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+30g/L蔗糖+7g/L 瓊脂，pH=5.8；

步驟（3）中所述莖尖預培養基配方為：MS+蔗糖+5.5g/L瓊脂粉；其中，所述蔗糖的濃度為0.5mol/L；

所述裝載溶液的配方為：MS+2mol/L甘油+0.75mol/L 蔗糖，pH=5.8；

所述PVS-2溶液的配方為：MS +30%甘油+15%聚乙二醇+15%DMSO +0.4 mol/L蔗糖，pH=5.8。

2.根據權利要求1所述的莖尖玻璃化超低溫脫除蘋果病毒的方法，其特征在于：所述預培養的條件為25℃下暗培養2天。

3.根據權利要求1所述的莖尖玻璃化超低溫脫除蘋果病毒的方法，其特征在于：所述PVS-2玻璃化處理的時間為90min。

4.根據權利要求1所述的莖尖玻璃化超低溫脫除蘋果病毒的方法，其特征在于：步驟（3）中所述液氮冷凍處理的時間為30~90min；所述水浴解凍處理的條件為：40℃水浴2min解凍，解凍速率為200℃/min；將解凍處理后的莖尖放入MS+1.2 mol/L的蔗糖溶液中浸泡處理的時間5~15min。

5.根據權利要求1所述的莖尖玻璃化超低溫脫除蘋果病毒的方法，其特征在于：步驟（3）中所述繼代擴繁培養后的組培苗為繼代五次的組培苗。

6.根據權利要求1所述的莖尖玻璃化超低溫脫除蘋果病毒的方法，其特征在于：步驟（4）中將超低溫處理后的莖尖接種在莖尖再生培養基上暗培養1周后，轉為光照培養，光照培養一個月后再將再生植株進行繼代擴繁。