[發明專利]一種植酸酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 201710913105.X
• 申請日: 2017-09-30
• 公開（公告）號: CN107488642B
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發明（設計）人: 王興吉;郭慶文;張杰;盛花開;劉文龍
• 申請（專利權）人: 山東隆科特酶制劑有限公司
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/55;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種植酸酶突變體及其應用。本發明通過PCR獲得來自枯草芽孢桿菌突變菌的耐熱植酸酶突變基因A?2，并將A?2構建到pPIC9質粒上，得到重組質粒pPIC9?A?2，并轉化到畢赤酵母GS115，篩選得到高表達耐熱植酸酶的重組菌，所表達的耐熱植酸酶在80℃保溫處理30min，相對活性仍剩余75％左右，90℃處理30min，酶活仍存留25％以上，耐熱性良好，可以廣泛用于食品、飼料等行業。

技術領域：

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種植酸酶突變體及其應用。

背景技術：

磷是動物機體必須的礦物元素，植物組織中的磷大部分是以植酸(肌醇六磷酸)或植酸鹽的形式存在，肌醇六磷酸分子可以螯合金屬離子，以螯合物的形式存在，其溶解度很低，作用相當于抗營養因子，很難被單胃動物吸收，未被充分利用的磷，通過動物排泄物進入水體最終導致水體富營養化。

植酸酶是催化植酸及其鹽類水解為肌醇與磷酸鹽的一類酶的總稱，在動物飼料中添加植酸酶，可以提高飼料中磷的利用率，減少磷的排出對環境的污染。1996年FDA確認植酸酶在食品中應用是安全的，可在動物飼料中使用，植酸酶已成為第三大飼用酶。可以通過微生物來大量合成植酸酶，添加到飼料中供動物體利用，以解決單胃動物缺乏能夠利用植酸鹽的植酸酶的問題，但是飼料加工過程中的熱處理要求植酸酶有一定耐熱性。而目前面臨的主要問題是植酸酶高昂生產成本、低植酸酶產率以及耐熱性不足。

發明內容：

本發明的目的在于提供一種耐熱性提高的植酸酶突變體及其畢赤酵母工程菌菌株。所述植酸酶突變體來自一株經紫外誘變獲得的枯草芽孢桿菌BS2，將植酸酶突變體編碼基因A-2從BS2中克隆并構建重組質粒后，在畢赤酵母GS115中進行表達，從而獲得畢赤酵母工程菌菌株。

在本發明中采用如下定義：

1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸殘基的公認IUPAC命名法，用三字母代碼形式。DNA核酸序列采用公認IUPAC命名法。

2.植酸酶突變體的標識

采用“原始氨基酸位置替換的氨基酸”來表示突變體中突變的氨基酸。如Gln166Asn，表示位置166的氨基酸由野生型的Gln替換成Asn，位置的編號對應于SEQ IDNo.2中野生型植酸酶的氨基酸序列編號；同樣采用“原始堿基位置替換的堿基”來表示突變體中突變的堿基，位置的編號對應于SEQ ID No.1中野生型植酸酶的核苷酸序列編號。

在本發明中，A-1表示野生型植酸酶的編碼基因，A-2表示植酸酶突變體的編碼基因，信息如下表。

所述植酸酶突變體的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示；

所述植酸酶突變編碼基因A-2的核苷酸序列為SEQ ID No.3所示；

用于表達所述植酸酶的表達載體為pPIC9，用于所述表達載體轉化的微生物宿主細胞為畢赤酵母GS115；

所述畢赤酵母工程菌是將植酸酶突變編碼基因A-2連接表達載體pPIC9，并在畢赤酵母GS115中表達所得；

本發明還提供上述植酸酶突變體在飼料領域的應用。

本發明的實驗步驟具體如下：

1、將植酸酶突變體的編碼基因A-2進行酶切，連接至表達載體pPIC9，得到重組載體；

2、將重組載體轉化入畢赤酵母GS115中，得到植酸酶突變體的生產菌株GS115/pPIC9-A-2；

3、以GS115/pPIC 9-A-2為生產菌株發酵生產植酸酶。

所述植酸酶突變體的酶學性質如下：