[發明專利]CRISPR/CAS9介導藥物轉運體靶向性敲除的caco?2細胞模型及其方法在審

申請號：	201710911586.0	申請日：	2017-09-29
公開（公告）號：	CN107760652A	公開（公告）日：	2018-03-06
發明（設計）人：	黃黎珍;鐘國瑞;謝水林;龐土慧;姜二崗;鄒淑香;李浩健;戴仁科	申請（專利權）人：	華南理工大學
主分類號：	C12N5/10	分類號：	C12N5/10;C12N15/85
代理公司：	廣州粵高專利商標代理有限公司44102	代理人：	何淑珍
地址：	510006 廣東省***	國省代碼：	廣東;44
權利要求書：	查看更多	說明書：	查看更多
摘要：
搜索關鍵詞：	crispr cas9 藥物轉運靶向 caco 細胞模型及其方法
鉆瓜網技術展會專利詞庫專利權人專利榜在售專利公布日期熱門專利

【說明書】：

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體涉及CRISPR/CAS9介導藥物轉運體靶向性敲除的caco-2細胞模型及其方法。

背景技術

藥物轉運研究是新藥研發過程的重要內容。轉運體，通過轉運體進行繼發性主動轉運，即依靠存在于細胞外高濃度鈉離子的勢能(該勢能由原發性主動轉運提供)轉運，即相當于間接消耗ATP的能量。例如小腸粘膜上皮細胞主動吸收葡萄糖的過程中，轉運能量并不直接來自于ATP的分解，而是依靠上皮細胞(低)與腸腔液(高)之間的鈉離子濃度梯度，在鈉離子順濃度梯度進入上皮細胞的同時，葡萄糖逆濃度梯度一同被轉運進細胞。ATP結合轉運體家族主要成員P-gp、BCRP及MRP2參與大量化合物轉運，是目前常用候選轉運體。然而三者底物及抑制劑的交叉反應嚴重影響結果分析。

CRISPR-Cas9具有更快速、簡便、高效、多位點、特異性靶向敲除基因的優勢。CRISPR-Cas9的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通過堿基配對與tracrRNA(trans-activating RNA)結合形成tracrRNA/crRNA復合物，此復合物引導核酸酶Cas9蛋白在與crRNA配對的序列靶位點剪切雙鏈DNA。而通過人工設計這兩種RNA，可以改造形成具有引導作用的sgRNA(singleguide RNA)，足以引導Cas9對DNA的定點切割。作為一種RNA導向的dsDNA結合蛋白，Cas9效應物核酸酶是已知的第一個統一因子(unifying factor)，能夠共定位RNA、DNA和蛋白，從而擁有巨大的改造潛力。將蛋白與無核酸酶的Cas9(Cas9 nuclease-null)融合，并表達適當的sgRNA，可靶定任何dsDNA序列，而sgRNA的末端可連接到目標DNA，不影響Cas9的結合。因此，Cas9能在任何dsDNA序列處帶來任何融合蛋白及RNA，這為生物體的研究和改造帶來巨大潛力。也為解決上述問題提供了一種可能的選擇。

發明內容

本發明的目的在于提供CRISPR/CAS9介導藥物轉運體靶向性敲除caco-2細胞模型及其方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案。

CRISPR/CAS9介導藥物轉運體靶向性敲除caco-2細胞模型的方法，該方法用于非診斷或治療目的，包括如下步驟：

1)對P-gp、BCRP及MRP2轉運體設計靶點特異性的sgRNA，設計的sgRNA序列如序列表中SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6所示，構建sgRNA表達載體；

2)利用CRISPR/CAS9分別設計P-gp、BCRP及MRP基因單敲除及兩兩組合雙敲除，與hCas9質粒共轉染caco-2細胞，進行單克隆化擴大培養，即得轉運體基因靶向性的caco-2細胞模型。

優選的，步驟1)中，以U6啟動子表達sgRNA，將設計的sgRNA序列合成Oligo，構建sgRNA表達載體。

本發明還提供由以上方法得到的caco-2細胞模型。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：

本發明通過CRISPR/CAS9結合細胞單克隆技術，對ABC家族P-gp、BCRP及MRP進行了系列單敲除或雙敲除，獲得一系列基因敲除的caco-2細胞模型。該caco-2細胞模型將有效排除不同轉運體之間相互干擾，為藥物轉運研究提供更特異、更靈敏的細胞模型。

附圖說明

圖1是靶位點PCR產物T7EI酶切后電泳結果圖；