[發明專利]一種由表皮干細胞誘導分化汗腺細胞的方法及其培養基組

有效

• 申請號: 201710909244.5
• 申請日: 2017-09-29
• 公開（公告）號: CN107828716B
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發明（設計）人: 黃燕飛;車七石;劉少輝
• 申請（專利權）人: 廣州潤虹醫藥科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 廣州市越秀區哲力專利商標事務所(普通合伙) 44288
• 代理人: 李天星;彭成

本發明公開了一種由表皮干細胞誘導分化汗腺細胞的方法，包括以下步驟：1)從離體皮膚組織中分離表皮干細胞，在表皮干細胞培養基進行傳代培養；2)將步驟1)得到的表皮干細胞進行傳代培養、加入汗腺細胞誘導培養基進行誘導分化；和3)利用汗腺細胞培養基進行傳代與增殖。本發明同時提供了相對應的培養基組。該方法細胞源有效地避免了倫理學爭議，該制備方法有助于制得細胞定向分化、增殖情況較均一的汗腺細胞。

技術領域

本發明涉及一種生物組織培養技術領域，尤其涉及一種由表皮干細胞誘導分化汗腺細胞的方法及其培養基組。

背景技術

皮膚是人體最大的器官，具有保護身體，排汗，感覺冷熱和壓力等功能。汗腺分泌汗液，散發體熱。大面積的燒傷病人，創面修復后，汗腺缺失，導致體溫調節功能受影響。人工皮膚修復創面，僅具有表皮、真皮層結構，無汗腺及其他皮膚附屬器。組織工程化皮膚難以構建汗腺，是目前有待解決的難題。模擬汗腺的發生機制來誘導干細胞向汗腺細胞定向分化，可能是重建汗腺的唯一途徑。以表皮干細胞來誘導分化汗腺細胞，而達到汗腺細胞擴增培養的目的，具有較好的應用前景，但表皮干細胞的細胞分化、代謝的機制尚不清晰，定向分化需要克服較多不確定因素。

發明內容

為了克服現有技術的不足，本發明的目的之一在于提供一種穩定的、定向分化的由表皮干細胞誘導分化汗腺細胞的方法。

本發明的目的之二在于提供上述由表皮干細胞誘導分化汗腺細胞的培養基組。

本發明的目的之一采用如下技術方案實現：

一種由表皮干細胞誘導分化汗腺細胞的方法，包括以下步驟：

1)從離體皮膚組織中分離表皮干細胞，在表皮干細胞培養基進行傳代培養；

所述表皮干細胞培養基為含有氫化可的松、胰島素、腺嘌呤、青霉素、人表皮生長因子、轉鐵蛋白、谷氨酸、Y-27632和羧甲基殼聚糖的DMEM培養基；

2)將步驟1)得到的表皮干細胞進行傳代培養，待其融合度達到80％時，棄去培養基，用DMEM/F12清洗，加入汗腺細胞誘導培養基進行誘導分化；

所述汗腺細胞誘導培養為含有人表皮生長因子、霍亂毒素、三碘甲狀腺原氨酸和氯化乙酰膽堿的DMEM培養基；

3)培養若干天后，待培養基內出現多邊形、鋪路石樣的細胞，即為汗腺細胞，將培養基換成汗腺細胞培養基，培養若干天后，進行傳代與增殖；

所述汗腺細胞培養基為含有EGF、牛垂體提取物、青霉素和鏈霉素的DMEM 培養基。

進一步地，步驟1)中，所述離體皮膚組織為健康幼兒包皮切割術后所棄的包皮。

進一步地，步驟1)中，從離體皮膚組織中分離表皮干細胞具體操作為：取 3-6歲健康幼兒包皮切割術后所棄的包皮，無菌條件下，氯霉素清洗皮膚組織，加分散酶于4℃作用18-24h，分離表皮組織；無菌PBS清洗表皮組織，0.25％胰酶-EDTA消化4h，加入表皮干細胞培養基終止，1000r/min，離心5min，收集表皮細胞，無菌PBS清洗三遍，加入表皮干細胞培養基重懸，置于Matrigel包被的培養板進行培養，得到表皮干細胞。

進一步地，步驟2)中，誘導分化時，每天更換汗腺細胞誘導培養基。

進一步地，所述表皮干細胞培養基為含有以最終濃度計的以下組分的 DMEM培養基：0.1-2ng/mL氫化可的松、0.01-1ng/mL胰島素、1-5×10-4mol/L 腺嘌呤、50-200IU/mL青霉素、5-50ng/mL人表皮生長因子、2-50μg/mL轉鐵蛋白、1-10μg/mL谷氨酸、1-20μM Y-27632和0.01-1mg/mL羧甲基殼聚糖。