[發明專利]一種由表皮干細胞誘導分化汗腺細胞的方法及其培養基組

有效

• 申請號: 201710909244.5
• 申請日: 2017-09-29
• 公開（公告）號: CN107828716B
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發明（設計）人: 黃燕飛;車七石;劉少輝
• 申請（專利權）人: 廣州潤虹醫藥科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 廣州市越秀區哲力專利商標事務所(普通合伙) 44288
• 代理人: 李天星;彭成

1.一種由表皮干細胞誘導分化汗腺細胞的方法，包括以下步驟：

1)從離體皮膚組織中分離表皮干細胞，在表皮干細胞培養基進行傳代培養；

所述表皮干細胞培養基為含有氫化可的松、胰島素、腺嘌呤、青霉素、人表皮生長因子、轉鐵蛋白、谷氨酸、Y-27632和羧甲基殼聚糖的DMEM培養基；

2)將步驟1)得到的表皮干細胞進行傳代培養，待其融合度達到80％時，棄去培養基，用DMEM/F12清洗，加入汗腺細胞誘導培養基進行誘導分化；

所述汗腺細胞誘導培養基為含有以最終濃度計的以下組分的DMEM培養基：25-100ng/mL人表皮生長因子、0.1-2×10^-10mol/L霍亂毒素、0.5-5×10^-7mol/L三碘甲狀腺原氨酸、2-8×10^-5mol/L氯化乙酰膽堿；

3)培養若干天后，待培養基內出現多邊形、鋪路石樣的細胞，即為汗腺細胞，將培養基換成汗腺細胞培養基，培養若干天后，進行傳代與增殖；

所述汗腺細胞培養基為含有以最終濃度計的以下組分的DMEM培養基：10-100ng/mLEGF、10-50mg/mL牛垂體提取物、50-200U/mL青霉素和50-200μg/mL鏈霉素。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中，所述離體皮膚組織為健康幼兒包皮切割術后所棄的包皮。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中，從離體皮膚組織中分離表皮干細胞具體操作為：取3-6歲健康幼兒包皮切割術后所棄的包皮，無菌條件下，氯霉素清洗皮膚組織，加分散酶于4℃作用18-24h，分離表皮組織；無菌PBS清洗表皮組織，0.25％胰酶-EDTA消化4h，加入表皮干細胞培養基終止，以1000r/min速度離心5min，收集表皮細胞，無菌PBS清洗三遍，加入表皮干細胞培養基重懸，置于Matrigel包被的培養板進行培養，得到表皮干細胞。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中，誘導分化時，每天更換汗腺細胞誘導培養基。

5.如權利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于，所述表皮干細胞培養基為含有以最終濃度計的以下組分的DMEM培養基：0.1-2ng/mL氫化可的松、0.01-1ng/mL胰島素、1-5×10^-4mol/L腺嘌呤、50-200IU/mL青霉素、5-50ng/mL人表皮生長因子、2-50μg/mL轉鐵蛋白、1-10μg/mL谷氨酸、1-20μM Y-27632和0.01-1mg/mL羧甲基殼聚糖。

6.一種由表皮干細胞誘導分化汗腺細胞的培養基組，包括以下培養基：

表皮干細胞培養基：含有氫化可的松、胰島素、腺嘌呤、青霉素、人表皮生長因子、轉鐵蛋白、谷氨酸、Y-27632和羧甲基殼聚糖的DMEM培養基；

汗腺細胞誘導培養：含有人表皮生長因子、霍亂毒素、三碘甲狀腺原氨酸和氯化乙酰膽堿的DMEM培養基；

汗腺細胞培養基：含有EGF、牛垂體提取物、青霉素和鏈霉素的DMEM培養基。

7.如權利要求6所述的培養基組，其特征在于，

所述表皮干細胞培養基為含有以最終濃度計的以下組分的DMEM培養基：0.1-2ng/mL氫化可的松、0.01-1ng/mL胰島素、1-5×10^-4mol/L腺嘌呤、50-200IU/mL青霉素、5-50ng/mL人表皮生長因子、2-50μg/mL轉鐵蛋白、1-10μg/mL谷氨酸、1-20μM Y-27632和0.01-1mg/mL羧甲基殼聚糖。

8.如權利要求6所述的培養基組，其特征在于，

所述汗腺細胞誘導培養基為含有以最終濃度計的以下組分的DMEM培養基：25-100ng/mL人表皮生長因子、0.1-2×10^-10mol/L霍亂毒素、0.5-5×10^-7mol/L三碘甲狀腺原氨酸、2-8×10^-5mol/L氯化乙酰膽堿；

所述汗腺細胞培養基為含有以最終濃度計的以下組分的DMEM培養基：10-100ng/mLEGF、10-50mg/mL牛垂體提取物、50-200U/mL青霉素和50-200μg/mL鏈霉素。