[發(fā)明專利]利用藍(lán)藻黃素蛋白FNR直觀檢測(cè)目的蛋白表達(dá)純化的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710908190.0
• 申請(qǐng)日: 2017-09-29
• 公開（公告）號(hào): CN107529549B
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭正高;董春霞;吉雅晴;李榮貴
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/62
• 分類號(hào): C12N15/62;C12N15/70;C07K19/00;C12N1/21;C12N9/02
• 代理公司: 北京萬象新悅知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11360
• 代理人: 李稚婷

本發(fā)明公開了一種利用藍(lán)藻黃素蛋白FNR直觀檢測(cè)目的蛋白表達(dá)純化的方法，首先構(gòu)建目的蛋白基因與藍(lán)藻fnr基因或其同源基因的融合基因，并將含該融合基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入表達(dá)菌種中進(jìn)行表達(dá)，通過觀察表達(dá)菌液破碎后的上清液和/或其純化組分的顏色來判斷融合蛋白是否被成功表達(dá)和/或純化，如果上清液和/或純化組分偏黃色，說明目的蛋白與藍(lán)藻FNR蛋白或其同源蛋白一起被表達(dá)和/或純化。該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)目的蛋白表達(dá)純化的直觀檢測(cè)，方便快捷。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種直觀檢測(cè)目的蛋白表達(dá)和純化的方法，特別涉及一種利用藍(lán)藻顯黃色的蛋白——鐵氧還蛋白還原酶FNR來直觀檢測(cè)目的蛋白表達(dá)和純化的方法。

背景技術(shù)

FNR(Ferredoxin-NADP⁺reductases)，也叫鐵氧還蛋白還原酶，是一種在生物體的多種代謝中起著重要作用的黃素酶。FNR能催化NADPH與鐵氧還蛋白(Ferredoxin，F(xiàn)d)或鐵硫蛋白之間的可逆反應(yīng)。FNR在多種代謝過程的電子傳遞中起控制作用。它含有一分子非共價(jià)結(jié)合的黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作為輔基，通過自身結(jié)合的FAD在不同的還原電勢(shì)反應(yīng)中進(jìn)行單電子或雙電子的傳遞。在植物(如豌豆、菠菜、小麥等)和藍(lán)藻的光合作用中，F(xiàn)NR參與光合電子傳遞，在光系統(tǒng)Ⅰ中還原Fd并將電子轉(zhuǎn)移給NADP⁺，從而提供必要的NADPH用于CO₂的固定。我們研究發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中重組表達(dá)的藍(lán)藻中FNR蛋白顯黃色。

目的蛋白在原核系統(tǒng)中的表達(dá)和純化是分子生物學(xué)研究和生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展過程中的重要工具，是對(duì)目的蛋白功能和性質(zhì)研究的基礎(chǔ)，更促進(jìn)了現(xiàn)代生物學(xué)科迅猛發(fā)展。在各種版本的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南中，目的蛋白的表達(dá)和純化的基本流程是：1、將目的基因克隆入合適的表達(dá)載體后導(dǎo)入原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)菌株；2、誘導(dǎo)表達(dá)菌株表達(dá)目的蛋白；3、通過目的蛋白所帶的融合標(biāo)簽如GST、His等，選擇不同性質(zhì)的柱料將目的蛋白與其它蛋白分離，從而達(dá)到純化目的蛋白的目的。

然而，目前沒有直觀實(shí)時(shí)檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)純化情況的方法。根據(jù)目前主流的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，無論先小量誘導(dǎo)檢測(cè)目的蛋白是否表達(dá)，還是最后檢測(cè)是否通過柱料得到了純化了的目的蛋白，都需要將蛋白樣品通過十二烷基硫酸銨-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后用蛋白染色的方法來檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)純化情況。SDS-PAGE檢測(cè)蛋白樣品需要將蛋白樣品制樣，配置聚丙烯酰胺凝膠，然后跑大約1個(gè)小時(shí)的蛋白電泳，最后還需要將蛋白染色才能最終知道目的蛋白是否已經(jīng)表達(dá)或者得到純化，這些檢測(cè)需要額外的步驟和時(shí)間。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種直觀實(shí)時(shí)檢測(cè)目的蛋白表達(dá)和純化的方法，以解決目前體外表達(dá)純化的目的蛋白需要通過SDS-PAGE來檢測(cè)、需要大量額外的時(shí)間來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作和其它實(shí)驗(yàn)試劑的配制，并且不能實(shí)時(shí)直觀檢測(cè)的技術(shù)問題。本發(fā)明通過將目的蛋白與藍(lán)藻色素蛋白融合表達(dá)來檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)和純化情況，提供了一條便捷直觀的方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明將目的蛋白與藍(lán)藻黃素蛋白FNR或其同源蛋白融合表達(dá)，由于FNR蛋白非共價(jià)結(jié)合的黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)呈現(xiàn)黃色，所以整個(gè)融合蛋白也呈現(xiàn)黃色。通過觀測(cè)融合蛋白的顏色來判斷目的蛋白是否已經(jīng)成功表達(dá)和/或純化，從而構(gòu)建了一種直觀實(shí)時(shí)檢測(cè)目的蛋白表達(dá)純化的便捷方法。具體的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種直觀檢測(cè)目的蛋白表達(dá)純化的方法，構(gòu)建目的蛋白基因與藍(lán)藻fnr基因或其同源基因的融合基因，并將含該融合基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入表達(dá)菌種中進(jìn)行表達(dá)，通過觀察表達(dá)菌液破碎后的上清液和/或其純化組分的顏色來判斷融合蛋白是否被成功表達(dá)和/或純化，如果上清液和/或純化組分偏黃色，說明目的蛋白與藍(lán)藻FNR蛋白或其同源蛋白一起被表達(dá)和/或純化。

進(jìn)一步的，在對(duì)表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行柱純化的過程中，通過觀察柱料是否變?yōu)辄S色可以判斷目的蛋白是否結(jié)合上柱料。