[發明專利]一種能高效分解甲酰胺和氧化亞磷酸鹽的重組大腸桿菌及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201710904085.X
• 申請日: 2017-09-29
• 公開（公告）號: CN107760642B
• 公開（公告）日: 2021-08-10
• 發明（設計）人: 婁文勇;區曉陽;李慧嫻;宗敏華;徐培;魏萍
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 何淑珍

本發明公開了一種能高效分解甲酰胺和氧化亞磷酸鹽的重組大腸桿菌及其構建方法與應用。本發明以大腸桿菌DH5α工程菌為宿主，將克隆得到的甲酰胺酶基因和亞磷酸脫氫酶基因依次連接在載體上得到重組質粒，并轉化入大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)中，誘導培養得到重組大腸桿菌。本發明的重組大腸桿菌同時含有甲酰胺酶基因和亞磷酸脫氫酶基因，能同時表達甲酰胺酶分解甲酰胺生成NH₄⁺和表達亞磷酸脫氫酶把亞磷酸鹽氧化磷酸鹽，為重組大腸桿菌工程菌提供生長繁殖所需要的氮源和磷源，而其他微生物不具備這兩條獲取營養途徑，使重組大腸桿菌成為優勢菌，解決了大腸桿菌在工業發酵中染菌問題，同時降低了發酵設備需求以及減少了抗生素的添加。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種能高效分解甲酰胺和氧化亞磷酸鹽的重組大腸桿菌及其構建方法與應用。

背景技術

近年來，隨著發酵行業的迅速發展，發酵技術、發酵設備不斷發展更新，在發酵管理經驗越來越豐富，技術手段越發成熟的情況下，各企業的發酵染菌率也有下降。但工業發酵過程中染菌現象還是時有發生，并且一旦染菌，不僅造成原材料浪費，而且會影響生產效率，費事費力，破壞生產計劃、擾亂生產秩序等。所以，要解決發酵中的染菌依舊是發酵企業最關切的問題之一。發酵過程通常是微生物純種培養過程，培養過程中只允許特定的微生物生長，如果發酵過程中除目的菌以外還有其他微生物存在，就視為染菌。染菌嚴重影響目的菌的生長，導致發酵失敗。造成發酵染菌的原因很多，除了人為操作上的原因，設備造成的發酵染菌占了很大部分。

目前關于發酵染菌的研究多集中在發酵染菌的來源(途徑)及相關的菌形、不同發酵階段染菌對發酵的影響及防治措施、從設備角度的分析和防治等方面。發酵企業為了降低染菌率，主要是從發酵設備的維護和處理入手，比如控制發酵罐空氣輸入系統和水循環系統無菌過濾處理，確保蒸汽消毒系統滅菌徹底，發酵環境衛生和物料處理，菌種的純度等。但是微生物無處不在，特別是一些具有孢子結構的微生物，蒸汽消毒可能也不能把它們“殺死”。所以，在發酵工程中難免會有雜菌的污染。

針對染菌現象，研究者很少從營養物質底物譜的攝取進行研究，本研究以大腸桿菌宿主細胞作為研究對象，因為大腸桿菌是使用最廣泛、最成功的表達體系。對大腸桿菌的營養代謝途徑進行改造，使改造后的大腸桿菌工程菌能分解甲酰胺產生氨作為氮源和分解氧化亞磷酸鹽成為磷酸鹽作為磷源，改變其氮源和磷源的來源途徑，使其在特定的MOPS培養基中能正常生長，而不同時具有這兩條代謝途徑的雜菌微生物就會由于缺乏氮源或磷源營養物質的來源而被“餓死”，從而使改造過的大腸桿菌工程菌成為特定培養基的優勢菌，雜菌就不能生長繁殖。經改造的大腸桿菌優勢工程菌的應用，一方面保證工程菌正常生長繁殖并表達質粒上的目標基因，另一方面還能在未滅菌的、開放式的發酵罐中進行發酵生產，而雜菌不能生長繁殖，而達到純培養的目的。

在分子生物學中，基因的重組表達技術已經相當成熟，可以利用基因工程的手段把不同來源的基因實現在同一大腸桿菌中共表達，從而可以賦予大腸桿菌擁有其他菌株的一些特殊代謝功能，使其能在發酵工業中得到更廣泛的應用，降低生產成本和設備要求。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供了一種能高效分解甲酰胺和氧化亞磷酸鹽的重組大腸桿菌。該重組大腸桿菌同時含有甲酰胺酶(FOR)基因和亞磷酸脫氫酶(PTDH)基因，能同時表達甲酰胺酶分解甲酰胺生成NH₄⁺和表達亞磷酸脫氫酶把亞磷酸鹽氧化磷酸鹽，為重組大腸桿菌工程菌提供生長繁殖所需要的氮源和磷源，而其他不同時具有這兩條代謝途徑的微生物則會由于缺乏氮源和磷源的代謝途徑而被“餓死”。