[發(fā)明專利]一種能高效分解甲酰胺和氧化亞磷酸鹽的重組大腸桿菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710904085.X
• 申請(qǐng)日: 2017-09-29
• 公開（公告）號(hào): CN107760642B
• 公開（公告）日: 2021-08-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 婁文勇;區(qū)曉陽(yáng);李慧嫻;宗敏華;徐培;魏萍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華南理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 何淑珍

1.一種能高效分解甲酰胺和氧化亞磷酸鹽的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增甲酰胺酶基因

上游引物A1即5'-CGCGGATCCGATGAACGGACTGGGCGGCTTGAAC-3'，下劃線斜體為BamH I酶切點(diǎn)；下游引物A2即5'-CCGGAATTCCGTCGCGCCGCGCCTCCCTTCGCTC-3'，下劃線斜體為EcoR I酶切點(diǎn)；

以保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO: M2014458的類芽孢桿菌（Paenibacillus pasadenensis.） CS0611的基因組為模板，克隆出1011 bp的甲酰胺酶基因序列，命名為for；將克隆得到的基因序列for連接到載體pETDuet-1上的第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，再將重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，得到含有重組載體pETDuet-for的重組大腸桿菌DH5α；

（2）設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增亞磷酸脫氫酶基因

上游引物B1即5'-GAAGATCTGATGCTGCCGAAACTCGTTATAACTC-3'，下劃線斜體為Bgl Ⅱ酶切點(diǎn)；下游引物B2即5'-GGGGTACCACATGCGGCAGGCTCGGCCTTGGGC-3'，下劃線斜體為Kpn Ⅰ酶切點(diǎn)；

以保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO. M 2017449肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia. ）OU7的基因組為模板，克隆出1008bp的亞磷酸脫氫酶基因序列，命名為ptx；將克隆得到的基因序列ptx連接到pETDuet-for的第二個(gè)多克隆位點(diǎn)上，得到甲酰胺酶基因for和亞磷酸脫氫酶基因ptx同時(shí)連接到同一表達(dá)質(zhì)粒的重組質(zhì)粒，命名為pETDuet-for-ptx；將重組質(zhì)粒pETDuet-for-ptx轉(zhuǎn)化入重組大腸桿菌DH5α；

（3）轉(zhuǎn)化表達(dá)重組菌株

從重組大腸桿菌DH5α中提取重組質(zhì)粒pETDuet-for-ptx，并將重組質(zhì)粒pETDuet-for-ptx轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)中；

（4）誘導(dǎo)培養(yǎng)重組大腸桿菌

將得到的重組表達(dá)菌株BL21(DE3)接種到LB培養(yǎng)基中，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)后，收集菌體并加入到含有甲酰胺和亞磷酸鹽的MOPS培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)得到重組大腸桿菌。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種能高效分解甲酰胺和氧化亞磷酸鹽的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（1）中，所述類芽孢桿菌Paenibacillus pasadenensis. CS0611的甲酰胺酶基因序列如SEQ ID NO.1所示，片段長(zhǎng)度為1011 bp，編碼337個(gè)氨基酸；所述類芽孢桿菌Paenibacillus pasadenensis. CS0611于2014年10月8日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO: M2014458。