[發明專利]三種重組糖化酶及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201710903102.8
• 申請日: 2017-09-29
• 公開（公告）號: CN107475219B
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發明（設計）人: 黎明;袁顥瑜;路福平
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N9/34
• 分類號: C12N9/34;C12N15/56;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 郭曉迪

本發明通過將GATE(GenBank ID：AJ304803.1)和GAA1(GenBank ID:HQ537427.1)兩種糖化酶基因的結構域重組及突變缺失，提供至少三種熱穩定性好且酶活力高的重組糖化酶、制備方法與應用。本發明三種重組糖化酶的氨基酸序列分別如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示。本發明還提供了包括編碼本發明糖化酶的核苷酸序列與表達載體連接而成的進行功能性表達的重組表達載體，以及包含有本發明重組表達載體的重組菌株及其后代。

技術領域

本發明屬于酶的基因工程技術領域，具體涉及到由兩種糖化酶結構域重組及突變獲得的三種重組糖化酶及其制備方法與應用。

背景技術

糖化酶(EC.3.2.1.3.)，又稱葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase,GA)，是一種具有外切酶活性的單鏈酸性糖苷水解酶，是水解淀粉產生葡萄糖的主要酶類，它能把淀粉從非還原性末端水解α-1,4葡萄糖苷鍵產生葡萄糖，也能緩慢水解α-1,6葡萄糖苷鍵，轉化為葡萄糖，同時也能水解糊精，糖原的非還原末端釋放β-D-葡萄糖。糖化酶有Ⅰ型(GAⅠ)和Ⅱ型(GAⅡ)2種類型，Ⅰ型有三個功能區催化結構域(CD)、O-糖基化連接域(Linker)及結合域(SBD)組成，Ⅱ型缺少SBD區域，少數甚至缺少O-糖基化連接域。

糖化酶是最早實現工業化生產的一種重要酶類，并且迄今為止仍是用途最廣、產量最大的酶制劑之一，被廣泛地應用于食品、醫藥、發酵等工業，具有很高的應用價值，受到國內外學者的高度重視。我國對于糖化酶的需求量呈逐年上升趨勢，糖化酶生產菌株產糖化酶的活力及耐受性有待進一步提高。

隨著研究的深入，對其酶學結構、作用機理、結構-功能相關性等問題有了一定的了解。近年來，越來越多的學者在分子水平上通過定點突變等方法對糖化酶結構域進行了研究，分析糖化酶的結構與功能的關系。本發明利用兩株產糖化酶菌種埃墨森籃狀菌(Talaromyces emersonii)和黑曲霉(Aspergillus niger)。前者產糖化酶的比活力較高，但酶的熱穩定性較差；后者的穩定性較好，但產糖化酶的比活力不高。

發明內容

本發明的目的是針對兩株產糖化酶菌種埃墨森籃狀菌(Talaromyces emersonii)和黑曲霉(Aspergillus niger)，前者產糖化酶的比活力較高，但酶的熱穩定性較差；后者的穩定性較好，但產糖化酶的比活力不高的現有問題，通過將兩種糖化酶基因的結構域重組及突變缺失，提供至少三種熱穩定性較好且酶活力較高的重組糖化酶、制備方法與應用。

本發明技術方案概述如下：

由親本埃墨森籃狀菌糖化酶GATE(GenBank ID：AJ304803.1)和黑曲霉糖化酶GAA1(GenBank ID:HQ537427.1)出發，通過PCR技術分別擴增兩種糖化酶基因的三個結構域CD、Linker和SBD，得到GATE和GAA1的六個結構域片段GATECD、GATEL、GATESBD、GAA1CD、GAA1L、GAA1SBD(核苷酸序列依次如SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：9所示)；通過重疊PCR技術，將上述結構域重組，獲得六種重組糖化酶GA1～GA6，篩選出其中酶活力較高的重組糖化酶GA1、GA2(氨基酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示)，再以重組糖化酶GA2為模板，通過PCR技術，擴增得到SBD區缺失突變的重組糖化酶GA7(氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示)，構建三種重組糖化酶的重組菌株，重組菌發酵高效表達重組糖化酶。

用于表達重組糖化酶的表達載體為pJ912-19；用于所述的表達載體轉化的微生物宿主細胞為畢赤酵母X-33。

本發明重組糖化酶GA1、GA2或GA7的制備步驟概述如下：