[發明專利]一種評價EML4?ALK抑制劑對肺癌治療效果的方法

在審

• 申請號: 201710903091.3
• 申請日: 2017-09-29
• 公開（公告）號: CN107828823A
• 公開（公告）日: 2018-03-23
• 發明（設計）人: 陳良;高磊
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司44245
• 代理人: 郭煒綿

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種評價藥物對EML4-ALK L1196M癌基因驅動的肺癌治療效果的方法。

背景技術

肺癌是全球范圍內發病率和致死率最高的癌癥。肺癌分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌。非小細胞肺癌按病理類型又分為腺癌、鱗癌和大細胞癌。肺癌的常規治療方法是化療，但化療的療效有限，并有較大的副作用。

近年來，靶向治療方法在肺癌治療中展示出了良好的臨床表現。靶向治療的理論基礎是：肺癌細胞的生存依賴于一個特定蛋白持續地執行功能，而非肺癌組織細胞則不依賴；用該蛋白的抑制劑治療病人，能造成肺癌細胞的死亡，而其他細胞則不受影響。因此，靶向治療具有高效性、低副作用的特點。

EML4-ALK融合癌基因在約5％的中國肺癌病人中呈陽性。臨床上用EML4-ALK的抑制劑(如克唑替尼)能有效地治療該基因陽性的肺癌。但這些病人的肺癌在短暫的消退之后又會復發。復發的一個重要原因是EML4-ALK融合基因本身發生了突變，造成藥物不能再抑制EML4-ALK的激酶活力。L1196M是臨床上常見的抗克唑替尼藥物的EML4-ALK的突變。開發抗L1196M突變的EML4-ALK的藥物是目前研究領域的一個熱點，也有一些藥物正在做臨床試驗或已獲批應用于臨床。

目前，評價L1196M突變的EML4-ALK的抑制劑治療肺癌的方法大概可以分為兩類：細胞模型和移植瘤模型。現在有一些肺癌細胞或人工轉化而成的細胞，其存活依賴于EML4-ALK L1196M突變體的持續功能。用抑制劑封閉該癌蛋白的功能就會引起細胞凋亡。測定凋亡嚴重性可以反映該抑制劑治療肺癌的能力。這種直接在細胞上測定藥物治療EML4-ALK L1196M效果的方法，有其固有的缺點：不能反映該藥物在活體上的表現，如急性毒性，慢性毒性，藥代動力學等。

另一種方法是將上述細胞移植到免疫缺陷的小鼠上，待小鼠長出移植瘤后，用藥物治療小鼠，測量腫瘤的體積變化來推斷藥物的治療效果。該模型的缺點是：接種的移植瘤不能真實模擬肺癌發生的微環境，同時免疫系統在腫瘤治療過程中起著重要的作用。因此，用免疫缺陷的移植瘤來評價藥物治療肺癌的能力有比較高的幾率出現誤判：即藥物在移植瘤模型上有效，而臨床上沒有效。

發明內容

為了克服現有技術的缺陷，本發明的目的在于提供一種評價藥物對EML4-ALK L1196M癌基因驅動的肺癌治療效果的方法，該方法的關鍵是在體外構建5’mROSA-CAG-lox-stop-lox-EML4-ALK L1196M-3’mROSA基因片段，然后將該基因片段與cas9酶和sgRNA共同注射到小鼠的胚胎中，小鼠出生后鑒定含有同源重組基因的小鼠，待小鼠發育至成年，激活EML4-ALK L1196M癌基因，就會誘發肺癌的原位瘤，然后對小鼠給藥治療，評價治療效果。本發明的評價方法能最大限度地模擬病人體內腫瘤微環境，是一種更為科學和客觀的評價方法。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種評價藥物對EML4-ALK L1196M癌基因驅動的肺癌治療效果的方法，包括以下步驟：

(1)利用PCR方法擴增EML4-ALK L1196M基因片段并在其5’端和3’端分別加上EcoRI和NotI酶切位點，將所得到的片段連接到pClatent質粒上，得到pClatent-EML4-ALK L1196M質粒；用PCR方法擴增小鼠ROSA26位點兩段序列作為同源臂，分別通過EcoRV和PacI、EcoRV和AscI插入到pClatent-EML4-ALK L1196M質粒上，從而得到mRosa-lsl-EML4-ALK L1196M質粒；用EcoRV酶將質粒上的載體片段(2.7Kb)切掉，得到5’mROSA-CAG-lox-stop-lox-EML4-ALK L1196M-3’mROSA基因片段(9.5Kb)；

步驟(1)所述的加上酶切位點的EML4-ALK L1196M基因片段的序列如SEQ.ID.NO.1所示；

步驟(1)所述小鼠ROSA26位點兩段序列分別如SEQ.ID.NO.9和SEQ.ID.NO.10所示；

步驟(1)所述的5’-mROSA-CAG-lox-stop-lox-EML4-ALK L1196M-3’mROSA基因片段其序列如SEQ.ID.NO.11所示；