[發(fā)明專利]一種評價EML4?ALK抑制劑對肺癌治療效果的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710903091.3
• 申請日: 2017-09-29
• 公開（公告）號: CN107828823A
• 公開（公告）日: 2018-03-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳良;高磊
• 申請（專利權(quán)）人: 暨南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司44245
• 代理人: 郭煒綿

1.一種評價藥物對EML4-ALK L1196M癌基因驅(qū)動的肺癌治療效果的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)利用PCR方法擴增EML4-ALK L1196M基因片段并在其5’端和3’端分別加上EcoRI和NotI酶切位點，將所得到的片段連接到pClatent質(zhì)粒上，得到pClatent-EML4-ALK L1196M質(zhì)粒；用PCR方法擴增小鼠ROSA26位點兩段序列作為同源臂，分別通過EcoRV和PacI、EcoRV和AscI插入到pClatent-EML4-ALK L1196M質(zhì)粒上，從而得到mRosa-lsl-EML4-ALK L1196M質(zhì)粒；用EcoRV酶將質(zhì)粒上的載體片段切掉，得到5’mROSA-CAG-lox-stop-lox-EML4-ALK L1196M-3’mROSA基因片段；

步驟(1)所述的加上酶切位點的EML4-ALK L1196M基因片段的序列如SEQ.ID.NO.1所示；

步驟(1)所述小鼠ROSA26位點兩段序列分別如SEQ.ID.NO.9和SEQ.ID.NO.10所示；

步驟(1)所述的5’-mROSA-CAG-lox-stop-lox-EML4-ALK L1196M-3’mROSA基因片段其序列如SEQ.ID.NO.11所示；

(2)將Cas9mRNA片段、gRNA片段和可誘導(dǎo)表達EML4-ALK L1196M的轉(zhuǎn)基因片段5’mROSA-CAG-lox-stop-lox-EML4-ALK L1196M-3’mROSA混合，通過顯微注射將混合物注射到小鼠的胚胎中，cas9在gRNA的引導(dǎo)下切開ROSA26位點，通過同源重組將可誘導(dǎo)表達的基因片段插入基因組；

步驟(2)所述的gRNA，其序列如SEQ.ID.NO.12所示；

(3)將步驟(2)得到的轉(zhuǎn)基因胚胎移植入代孕鼠子宮，飼養(yǎng)并待小鼠出生，設(shè)計三對引物分別對5’插入位點、3’插入位點和EML4-ALK L1196M基因進行PCR鑒定，篩選全部陽性的轉(zhuǎn)基因小鼠；

(4)轉(zhuǎn)基因陽性的小鼠飼養(yǎng)至成年，把含有CRE重組蛋白酶基因的病毒從鼻腔滴入小鼠肺中，從而將肺上皮細胞中的EML4-ALK L1196M癌基因激活，20天后小鼠得肺腺癌；通過CT檢測和病理切片證實肺癌組織的存在；

(5)對小鼠給藥，給藥結(jié)束，CT檢測肺癌大小，與治療前的大小進行比較；

(6)治療結(jié)束后，處死小鼠，制備小鼠肺組織的病理切片，讀取病理切片上的肺癌病理變化；再與CT檢測結(jié)果結(jié)合，判斷藥物治療EML4-ALK L1196M驅(qū)動肺癌的能力。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(2)所述的混合物中，Cas9mRNA片段的濃度為80ng/μL；gRNA片段的濃度為30ng/μL；轉(zhuǎn)基因片段5’mROSA-CAG-lox-stop-lox-EML4-ALK L1196M-3’mROSA的濃度為8ng/μL。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(2)所述的注射，注射量為15pL。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(3)所述的將轉(zhuǎn)基因胚胎移植入代孕鼠子宮，是將假孕的代孕鼠麻醉后，從腹部開口，暴露出輸卵管口，將轉(zhuǎn)基因胚胎移植入代孕鼠子宮后，用傷口夾封閉皮膚。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(4)所述的成年是6-8周齡。