[發明專利]一種用于擴增T淋巴細胞的納米級膜性囊泡的制備方法

在審

• 申請號: 201710902787.4
• 申請日: 2017-09-29
• 公開（公告）號: CN109576219A
• 公開（公告）日: 2019-04-05
• 發明（設計）人: 李鐵鵬;高全立;王瑤
• 申請（專利權）人: 河南省腫瘤醫院
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;A61K9/127;A61P35/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種用于擴增T淋巴細胞的納米級膜性囊泡的制備方法，該方法制備步驟包括：(1)，包裝細胞的培養；(2)，包裝細胞的滅活；(3)，滅活的包裝細胞與T淋巴細胞活化混合物的共同孵育；(4)，利用擠壓技術(Extrusion)將細胞懸液制備為囊泡懸液；(5)，通過密度梯度離心法分離包裹有T淋巴細胞活化混合物的膜性囊泡。該方法能夠滿足藥品生產質量管理規范(GMP)，且容易實現批量、標準化生產。利用該方法能夠以相對較低廉的成本獲取數量較多囊泡；該方法能夠通過人為控制囊泡內含物(T淋巴細胞活性物質)的種類和數量進而制備滿足不同應用需求的膜性囊泡。

技術領域

本發明涉及生物醫學技術領域，尤其涉及一種用于擴增T淋巴細胞的納米級膜性囊泡的制備方法。

背景技術

T淋巴細胞在機體免疫中發揮不可替代的作用。目前T淋巴細胞相關的生物制品已經廣泛應用于包括惡性腫瘤免疫細胞治療在內的多個領域。因而，優化擴增T淋巴細胞方案能夠推動T淋巴細胞制品在臨床中的應用。

傳統的符合臨床應用規范的T淋巴細胞擴增方案主要依賴于滿足GMP要求的T淋巴細胞活化珠子(該珠子表面粘附有活化所需的抗CD3活化抗體和抗CD28抗體)和以游離狀態提供的白細胞介素2(IL-2)的共同作用。該方案在以下兩個方面具有改進的需求：一，該珠子價格昂貴且技術為跨國公司壟斷，提高了臨床推廣難度；二，該珠子生物兼容性差，為避免珠子在患者體內積累，需要在T淋巴細胞制品回輸患者前去除，增加了額外的操作步驟。

囊泡是一種細胞分泌的具有磷脂雙層膜結構的小囊泡。囊泡內部可以包裹蛋白、核酸等物質，可以作為生物活性物質運輸或傳遞的天然載體(且具有較高的生物兼容性)。另外，囊泡表面存在的蛋白或磷脂可以作為運輸的“向導”，能夠實現囊泡內生物活性物質的靶向特定細胞遞送。然而，天然分泌的囊泡因產量低，包裹物質的種類以及數量不受控制，嚴重制約了囊泡作為藥物或者生物活性物質載體的應用。因此，探索利用物理、化學等人工手段獲取大量，且能夠主動包裹(或負載)特定種類、數量的生物活性物質的囊泡，使其能夠滿足生物醫學研究及應用具有重大意義。

發明內容

本發明的目的在于提供了一種用于擴增T淋巴細胞的納米級膜性囊泡的制備方法，該方法能夠滿足藥品生產質量管理規范(GMP)，且容易實現批量、標準化生產。利用該方法能夠以相對較低廉的成本獲取數量較多膜性囊泡，且可以通過人為控制囊泡內含物(T淋巴細胞活性物質)的種類和數量進而制備滿足不同應用需求的膜性囊泡。本發明的技術方案是這樣實現的：

本發明提供了一種用于擴增T淋巴細胞的納米級膜性囊泡的制備方法，其特征在于，它包含如下步驟：

S1：包裝細胞的培養；

S2：包裝細胞的滅活；

S3：滅活的包裝細胞與T淋巴細胞活化混合物的共孵育；

S4：利用擠壓技術(Extrusion)制備囊泡懸液；

S5：密度梯度離心法純化包裹T淋巴細胞活化混合物的囊泡。

優選的，步驟S1所述的包裝細胞可以為除T淋巴細胞之外的原代細胞或永生化的細胞株(系)，且不限于未經基因修飾的細胞，培養在37℃、含5％的二氧化碳和95％空氣的飽和濕度溫箱中進行；

優選的，步驟S2所述的細胞滅活方法可以為一定劑量的伽馬射線照射(例如20-500GR)，也可以為某些化療藥物的處理(例如15ug/ml的絲裂霉素處理4個小時)；

優選的，步驟S3所述的T淋巴細胞活化混合物包括但不限于：抗CD3活化抗體(克隆號OKT3)，抗CD28活化抗體，白細胞介素2，白細胞介素7，白細胞介素15，白細胞介素21等；