[發(fā)明專利]RT-qPCR檢測獼猴SLC2A9/GLUT9基因轉(zhuǎn)錄水平的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710902523.9
• 申請日: 2017-09-29
• 公開（公告）號: CN108330174B
• 公開（公告）日: 2022-02-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 唐東紅;王陳蕓;葉尤松;李哲麗;馬開利;魯帥堯;楊浩;肖涵;邱炳玲;陳倩;楊忠
• 申請（專利權(quán)）人: 中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 徐玲菊

1.引物對組在制備RT-qPCR法檢測獼猴SLC2A9基因轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于所述引物對組如下：

獼猴SLC2A9基因表達水平的特異性引物為：

SLC2A9 F：5’- CCACGCTACCTGCTCTTGGA -3’

SLC2A9 R：5’- TGCTTTACCCAAGAACGTTTGGA -3’

作為內(nèi)參基因的獼猴GAPDH基因的引物為：

GAPDH F：5＇-AGCCCCATCACCATCTTCC-3＇

GAPDH R：5＇- AATGAGCCCCAGCCTTCTC -3＇；

RT-qPCR法檢測獼猴SLC2A9基因轉(zhuǎn)錄水平的方法包括下列步驟：

（1）設(shè)計所述引物對組；

（2）以獼猴新鮮腎臟組織提取的總RNA為模板，按常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄合成，得獼猴腎臟組織cDNA第一鏈；

（3）以步驟（2）的獼猴腎臟組織cDNA第一鏈為cDNA模板，以步驟（1）中的SLC2A9 F、SLC2A9 R以及GAPDH F、GAPDH R為特異性引物，分別在下列PCR擴增體系及反應(yīng)條件下進行實時熒光定量PCR擴增，擴增結(jié)束后根據(jù)熒光信號的數(shù)據(jù)，分別獲得SLC2A9基因片段和內(nèi)參基因GAPDH片段的Ct值及熔解峰；

所述PCR擴增體系及反應(yīng)條件如下：

PCR擴增體系即25μL體系：

SYBR Premix Ex Taq II 酶 12.5μL，cDNA模板1μL，SLC2A9 F 和SLC2A9 R上、下游引物各1μL，去離子水9.5μL；

SYBR Premix Ex Taq II 酶 12.5μL，cDNA模板1μL，GAPDH F和GAPDH R上、下游引物各1μL，去離子水9.5μL；

反應(yīng)條件：94℃預變性30s，94℃變性5s、60℃退火30s、40個循環(huán)，59℃到94℃每5s采集一次熒光信號；

（4）將步驟（2）的獼猴腎臟組織cDNA第一鏈稀釋為10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4倍濃度作為cDNA模板，以步驟（1）中的SLC2A9 F、SLC2A9 R以及GAPDH F、GAPDH R為特異性引物，分別按步驟（3）的PCR擴增體系及反應(yīng)條件進行熒光定量PCR擴增，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)熒光信號的數(shù)據(jù)，獲得Ct值，通過qPCR儀器自帶CFXManager 軟件建立SLC2A9基因和內(nèi)參基因GAPDH的熔解曲線及標準曲線，得到SLC2A9基因片段及內(nèi)參基因GAPDH片段的擴增效率、斜率及R² 值；

（5）在步驟（3）的PCR擴增體系及反應(yīng)條件下，以步驟（2）的獼猴腎臟組織cDNA第一鏈作為待測樣品cDNA模板，進行實時熒光定量PCR擴增，得到對應(yīng)的Ct值，將該Ct值以及步驟（4）得到的SLC2A9基因及內(nèi)參基因GAPDH的擴增效率，通過qPCR儀器自帶CFX Manager 軟件處理，得出均一化后的SLC2A9基因倍數(shù)表達的ΔΔC(t)值，從而獲得SLC2A9基因轉(zhuǎn)錄水平相對表達值。