[發明專利]RT-qPCR檢測樹鼩SLC22A12/URAT1基因轉錄水平的方法在審

申請號：	201710902502.7	申請日：	2017-09-29
公開（公告）號：	CN108330172A	公開（公告）日：	2018-07-27
發明（設計）人：	唐東紅;王陳蕓;葉尤松;李哲麗;馬開利;魯帥堯;肖涵;邱炳玲;陳倩;楊浩;楊忠	申請（專利權）人：	中國醫學科學院醫學生物學研究所
主分類號：	C12Q1/68	分類號：	C12Q1/68
代理公司：	昆明正原專利商標代理有限公司 53100	代理人：	徐玲菊
地址：	650118 云***	國省代碼：	云南;53
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摘要：
搜索關鍵詞：	基因轉錄水平腎臟組織檢測實時熒光定量PCR 實時定量PCR 陰離子轉運提取總RNA 基因片段可重復性擴增效率內參基因特異性強有效途徑均一化靈敏性逆轉錄尿酸鹽擴增溶解合成基因新鮮研究
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【權利要求書】：

1.一種RT-qPCR檢測樹鼩SLC22A12/URAT1基因轉錄水平的方法，其特征在于包括下列步驟：

（1）設計下列引物：

樹鼩SLC22A12/URAT1表達水平的特異性上、下游引物為：

SLC22A12/ URAT1 F：5＇- CTACGACCACGGCACTTTCA-3＇

SLC22A12/ URAT1 R：5＇- AAGGTAACTCCAGGTCAGCAC-3＇

作為內參基因的樹鼩GAPDH基因的特異性上、下游引物為：

GAPDH F：5＇-AGCCCCATCACCATCTTCC-3＇

GAPDH R：5＇- AATGAGCCCCAGCCTTCTC -3＇；

（2）以樹鼩新鮮腎臟組織提取的總RNA為模板，按常規逆轉錄合成得樹鼩腎臟組織cDNA第一鏈；

（3）以步驟（2）的樹鼩腎臟組織cDNA第一鏈為cDNA模板，以步驟（1）中的SLC22A12/URAT1 F和SLC22A12/URAT1 R上、下游引物以及GAPDH F和GAPDH R上、下游引物為特異性引物，分別在下列PCR擴增體系及反應條件下進行實時熒光定量PCR擴增，擴增結束后根據熒光信號的數據，分別獲得SLC22A12/URAT1基因片段及內參基因GAPDH片段的Ct值及溶解峰；

所述PCR擴增體系及反應條件如下：

PCR擴增體系即25μL體系：

SYBR Premix Ex Taq II 酶 12.5μL，cDNA模板1μL，SLC22A12/URAT1 F和SLC22A12/URAT1 R上、下游引物各1μL，去離子水9.5μL；

SYBR Premix Ex Taq II 酶 12.5μL，cDNA模板1μL，GAPDH F和GAPDH R上、下游引物各1μL，去離子水9.5μL；

反應條件：94℃預變性30s，94℃變性5s、60℃退火30s、40個循環，59℃到94℃每5s采集一次熒光信號；

（4）將步驟（2）的樹鼩腎臟組織cDNA第一鏈稀釋為10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4倍濃度作為cDNA模板，以步驟（1）中的SLC22A12/URAT1 F和SLC22A12/URAT1 R以及GAPDH F和GAPDH R為特異性引物，分別按步驟（3）的PCR擴增體系及反應條件進行熒光定量PCR擴增，反應結束后根據熒光信號的數據，獲得Ct值，通過qPCR儀器自帶CFXManager 軟件建立SLC22A12/URAT1基因及內參基因GAPDH的標準曲線，得到SLC22A12/URAT1基因片段及內參基因GAPDH片段的擴增效率、斜率及R² 值；

（5）在步驟（3）的PCR擴增體系及反應條件下，以步驟（2）的樹鼩腎臟組織cDNA第一鏈作為待測樣品cDNA模板，進行實時熒光定量PCR擴增，得到對應的Ct值，將該Ct值以及步驟（4）得到的SLC22A12/URAT1目的基因及內參基因GAPDH的擴增效率，通過qPCR儀器自帶CFXManager 軟件處理，得出均一化后的SLC22A12/URAT1基因倍數表達的ΔΔC(t)值，從而獲得SLC22A12/URAT1基因轉錄水平相對表達值。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟3）獲得的PCR 擴增產物SLC22A12/URAT1基因片段及內參基因GAPDH片段分別經過下列驗證：

1）通過商業生物公司測序分別得到：

所擴增的樹鼩SLC22A12/URAT1基因片段核苷酸序列為：

AAGGCTGGGACTGGTGTGTGACTCTCGGGCCCTGAAGCCCATGTCCCAGTCCATCTACTTGACTGGGATGCTGGTGGGAGCTGCTGTGTGTGGCCATGCCTCAGACAGGTTTGGGCGCAGGCTGGTGCTGACCTGGAGTTACCTTT

所擴增的樹鼩樹鼩內參基因GAPDH片段核苷酸序列為：

ATCAAATGGGGTGATGCTGGTGCCGAGTATGTTGTGGAGACCACCGGTGTCTTCACCACCATGGAGAAGGCTGGGGCTCATTC

2）將步驟1）測序所得核苷酸序列分別通過DNAMAN軟件與NCBI所報道的食蟹猴的SLC22A12/URAT1基因及樹鼩GAPDH基因的核苷酸序列進行同源性比對，結果顯示：用本發明提供的引物、擴增體系及反應條件進行擴增后的樹鼩腎臟組織中SLC22A12/URAT1基因與NCBI報導的食蟹猴SLC22A12/URAT1序列（AB738914.1）的同源性為88.54%；用本發明提供的引物、擴增體系及反應條件進行擴增后的樹鼩腎臟組織中GAPDH與NCBI報道的樹鼩GAPDH序列（NM--001195426.1 0）的同源性為91.14%，證明本發明擴增出的目的片段分別為樹鼩SLC22A12/URAT1基因片段及GAPDH基因片段。