[發(fā)明專利]RT-qPCR檢測樹鼩SLC22A12/URAT1基因轉錄水平的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710902502.7
• 申請日: 2017-09-29
• 公開（公告）號: CN108330172A
• 公開（公告）日: 2018-07-27
• 發(fā)明（設計）人: 唐東紅;王陳蕓;葉尤松;李哲麗;馬開利;魯帥堯;肖涵;邱炳玲;陳倩;楊浩;楊忠
• 申請（專利權）人: 中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 徐玲菊

本發(fā)明提供一種RT?qPCR檢測樹鼩SLC22A12/URAT1基因轉錄水平的方法。以樹鼩新鮮腎臟組織提取總RNA，按常規(guī)逆轉錄合成得樹鼩腎臟組織cDNA第一鏈為模板，利用PCR引物組合進行實時熒光定量PCR擴增，獲得SLC22A12/URAT1基因片段及內(nèi)參基因GAPDH片段的Ct值、溶解峰及擴增效率；通過處理得出均一化后的SLC22A12/URAT1基因倍數(shù)表達的ΔΔC(t)值而獲得SLC22A12/URAT1基因轉錄水平相對表達值。為研究樹鼩尿酸鹽陰離子轉運體1功能以及相關藥物對其影響提供了有效途徑。本發(fā)明適用于實時定量PCR檢測，其靈敏性高、特異性強、操作簡單，可重復性高。

技術領域

本發(fā)明涉及一種檢測方法，尤其是一種用實時熒光定量RT-qPCR法檢測樹鼩尿酸鹽陰離子轉運體1（SLC22A12/URAT1）轉錄水平的方法，屬于分子生物技術領域。

背景技術

尿酸鹽陰離子轉運體1（urate anion transporter 1， URAT1）是人腎小管重吸收尿酸的主要轉運蛋白,是第一個被發(fā)現(xiàn)的與腎臟尿酸鹽轉運的相關蛋白，主要存在于腎小管上皮細胞刷狀緣膜上，屬于有機陰離子轉運蛋白( OAT) 家族，編碼基因為SLC22A12，通過介導尿酸從管腔內(nèi)利用重吸收作用( 管腔兩側的濃度梯度和化學梯度) 轉運到腎小管上皮細胞，具有強大的尿酸重吸收能力。機體內(nèi), 尿酸經(jīng)腎小球濾過、腎小管重吸收、腎小管再分泌及分泌后重吸收4 個過程排泄出體外, 而原尿中90%的尿酸被近曲小管S1 段的URAT1重吸收進入上皮細胞, 繼而重新進入血液循環(huán)，UＲAT1 對近曲小管重吸收起到了關鍵性的調(diào)節(jié)作用，抑制URAT1 將大大減少尿酸重吸收而促進尿酸排泄。

近年來，隨著人民生活水平的提高，飲食結構和生活習慣的改變，高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）的患病率逐年增高，流行病學研究資料表明高尿酸血癥和原發(fā)性痛風的發(fā)病呈上升趨勢，在中國，已經(jīng)有1.2億的HUA人群，大約占總人口的10%，中老年及絕經(jīng)后的婦女為高發(fā)人群，近年來發(fā)病年齡也呈年輕化的趨勢。高尿酸血癥與肥胖、高血壓、高脂血癥、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、胰島素抵抗的發(fā)生密切相關，已成為識別代謝綜合征的早期標志，治療和控制高尿酸血癥已成為代謝性疾病治療的重要組成部分。無論是藥物的篩選, 還是致病機制的研究, 都需要選擇一種科學、合理的動物模型來開展高尿酸血癥致病機理的研究及開發(fā)相關降血尿酸的藥物。

樹鼩（Tupaia belangeri,tree shrews)，是一種非嚙齒類哺乳動物，其分類地位介于靈長目與食蟲目之間。樹鼩具有體型小，易飼養(yǎng)和操作，管理方便，廉價經(jīng)濟，且其進化程度高，新陳代謝和大體解剖比犬、大小鼠等動物與人更為接近，解剖結構也更近似于人，因此其作為較理想的實驗動物在醫(yī)學與生物學的研究中廣泛應用。利用親緣關系與人類接近的實驗動物——樹鼩來開展高尿酸血癥致病機理的研究及開發(fā)相關降血尿酸的藥物，需要建立一種樹鼩尿酸鹽陰離子轉運體1，即SLC22A12/URAT1 mRNA 表達的相對定量方法，以研究藥物作用樹鼩體內(nèi)SLC22A12/URAT1基因的轉錄水平變化，進而為研究URAT1功能及其對機體血清尿酸的影響因素打下基礎。因此, 建立RT-qPCR檢測樹鼩尿酸鹽陰離子轉運體1（ SLC22A12/URAT1）基因轉錄水平的方法，可對于開展利用動物模型開展的HUA發(fā)病機制研究及新藥篩選具有重要意義。

實時熒光定量PCR的基因擴增法已被廣泛應用于基因轉錄水平的定量研究。該方法具有特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、自動化程度高、全封閉反應等優(yōu)點。目前國內(nèi)外還未見利用樹鼩進行SLC22A12/URAT1轉錄水平定量檢測方法的研究。

發(fā)明內(nèi)容