[發明專利]一種亞硝酸降解分析低分子肝素二糖結構的方法

在審

• 申請號: 201710898926.0
• 申請日: 2017-09-28
• 公開（公告）號: CN107727762A
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發明（設計）人: 遲連利;于萌琪;謝少帥
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司37219
• 代理人: 楊樹云

技術領域

本發明涉及一種亞硝酸降解分析低分子肝素二糖結構的方法，具體涉及一種將低分子肝素經亞硝酸降解后，通過多孔石墨化碳色譜與高分辨率質譜聯用分析低分子肝素二糖組成單元的方法，屬于藥物、原料藥、原料檢測技術領域。

背景技術

肝素是糖胺聚糖家族中的一類，被應用于臨床抗血栓治療。但長期以來，肝素類藥物在臨床治療過程中一直存在一定的治療風險。而肝素經物理方法、化學方法或者酶法降解制備而成的低分子肝素不僅具有肝素的抗血栓特點，并且降低了出血的風險，從而被廣泛應用，這也使得對低分子肝素進行結構表征變得更加迫切。

由于低分子肝素結構組成的不均一性，硫酸化、乙酰化程度的不穩定性、糖醛酸差向異構等的復雜性，對其進行結構表征有較大難度。對低分子肝素二糖組成單元進行分析是對其結構表征的重要方面，通常分析低分子肝素二糖單元的方法有：將肝素經肝素酶完全降解后采用親水相互作用色譜法，具體參見Li G,et al.Journal of Analytical Chemistry,2014,86(13):6626-6632。但低分子肝素經肝素酶完全降解后會破壞糖醛酸差向異構等信息，且以上常用的色譜法均無法分離肝素二糖組成單元中糖醛酸的同分異構體。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供一種亞硝酸降解分析低分子肝素二糖結構的方法，通過亞硝酸降解低分子肝素后采用多孔石墨化碳色譜法，對低分子肝素二糖結構中糖醛酸的同分異構體有極高的分辨能力，從而對其進行定性分析。

發明概述

本發明將低分子肝素經亞硝酸降解后，進行多孔石墨化碳色譜與高分辨率質譜聯用分析肝素二糖組成單元中糖醛酸的同分異構體。通過亞硝酸將低分子肝素降解成二糖單元，并通過多孔石墨化碳色譜法分離各同分異構體，再通過高分辨率質譜獲取精確分子量，從而對低分子肝素完全降解的二糖單元進行分析。

發明詳述

一種亞硝酸降解分析低分子肝素二糖結構的方法，包括步驟如下：

(1)配制肼解溶液：配制硫酸肼濃度為0.5-2％(w/w)、肼濃度為40-80％(v/v)的肼解溶液；

(2)稱量一定量的低分子肝素樣品，將其溶解在步驟(1)配制的肼解溶液中，低分子肝素的濃度為0.5～1mg/mL；在90-98℃下加熱3-5h后，停止加熱并冷卻到0℃以下；在20-40℃下反復蒸發，直至徹底除去殘留肼，獲取轉干的肼解過的低分子肝素樣品；

(3)配制pH值為1.5-2的HNO₂試劑；

(4)將步驟(2)獲取的低分子肝素樣品溶解于步驟(3)獲取的HNO₂試劑中，低分子肝素樣品的濃度為0.5～1mg/mL，冰浴振蕩15～20min后，將pH值調至3.5-4.5；

(5)配制pH值為3.5-4.5的HNO₂試劑；

(6)加入與步驟(4)最終獲取的溶液等體積的步驟(5)配制的HNO₂試劑于步驟(4)最終獲取的溶液中，冰浴振蕩30～40min后，將pH值調至8-10；

(7)加入與步驟(2)中稱量的低分子肝素樣品1-2倍質量的硼氫化物溶液于步驟(6)最終獲取的溶液中；25-50℃下還原8～12h；

(8)將步驟(7)最終獲取的溶液的pH值調至3-5后，反應15～20min后，再將溶液的pH調至中性，獲得HNO₂降解后的低分子肝素樣品；

(9)采用G-10色譜法進行一次脫鹽，一次脫鹽完成后進入步驟(10)或步驟(11)；

(10)通過GPC色譜法進行二次脫鹽，二次脫鹽完成后進入步驟(12)；

(11)PGC色譜與質譜聯用分析：將步驟(9)脫鹽后的經過HNO₂降解的低分子肝素樣品溶于去離子水，配制成濃度為0.5～2mg/mL的待測溶液；

配制流動相A：配制0.1-0.2％的甲酸，并用氨水調pH至5-6；

配制流動相B：配制0.1-0.2％的甲酸，80-90％的乙腈，用氨水調pH至5-6；

用多孔石墨化碳色譜柱分離，流速為100-200μL/min，洗脫梯度如下，均為體積百分比：

0～30min，100％流動相A；30-34min，83-87％流動相A，13-17％流動相B；34～90min，83-87％流動相A，13-17％流動相B；90～100min，100％流動相B；100～115min，100％流動相A；進入步驟(13)；