[發(fā)明專利]一種亞硝酸降解分析低分子肝素二糖結(jié)構(gòu)的方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201710898926.0 | 申請日： | 2017-09-28 |
| 公開（公告）號： | CN107727762A | 公開（公告）日： | 2018-02-23 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 遲連利;于萌琪;謝少帥 | 申請（專利權(quán)）人： | 山東大學(xué) |
| 主分類號： | G01N30/02 | 分類號： | G01N30/02 |
| 代理公司： | 濟(jì)南金迪知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司37219 | 代理人： | 楊樹云 |
| 地址： | 250199 山*** | 國省代碼： | 山東;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 亞硝酸 降解 分析 分子 肝素 結(jié)構(gòu) 方法 | ||
1.一種亞硝酸降解分析低分子肝素二糖結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于，包括步驟如下：
(1)配制肼解溶液：配制硫酸肼濃度為0.5-2％(w/w)、肼濃度為40-80％(v/v)的肼解溶液；
(2)稱量一定量的低分子肝素樣品，將其溶解在步驟(1)配制的肼解溶液中，低分子肝素的濃度為0.5～1mg/mL；在90-98℃下加熱3-5h后，停止加熱并冷卻到0℃以下；在20-40℃下反復(fù)蒸發(fā)，直至徹底除去殘留肼，獲取轉(zhuǎn)干的肼解過的低分子肝素樣品；
(3)配制pH值為1.5-2的HNO2試劑；
(4)將步驟(2)獲取的低分子肝素樣品溶解于步驟(3)獲取的HNO2試劑中，低分子肝素樣品的濃度為0.5～1mg/mL，冰浴振蕩15～20min后，將pH值調(diào)至3.5-4.5；
(5)配制pH值為3.5-4.5的HNO2試劑；
(6)加入與步驟(4)最終獲取的溶液等體積的步驟(5)配制的HNO2試劑于步驟(4)最終獲取的溶液中，冰浴振蕩30～40min后，將pH值調(diào)至8-10；
(7)加入與步驟(2)中稱量的低分子肝素樣品1-2倍質(zhì)量的硼氫化物溶液于步驟(6)最終獲取的溶液中；25-50℃下還原8～12h；
(8)將步驟(7)最終獲取的溶液的pH值調(diào)至3-5后，反應(yīng)15～20min后，再將溶液的pH調(diào)至中性，獲得HNO2降解后的低分子肝素樣品；
(9)采用G-10色譜法進(jìn)行一次脫鹽，一次脫鹽完成后進(jìn)入步驟(10)或步驟(11)；
(10)通過GPC色譜法進(jìn)行二次脫鹽，二次脫鹽完成后進(jìn)入步驟(12)；
(11)PGC色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析：將步驟(9)脫鹽后的經(jīng)過HNO2降解的低分子肝素樣品溶于去離子水，配制成濃度為0.5～2mg/mL的待測溶液；
配制流動(dòng)相A：配制0.1-0.2％的甲酸，并用氨水調(diào)pH至5-6；
配制流動(dòng)相B：配制0.1-0.2％的甲酸，80-90％的乙腈，用氨水調(diào)pH至5-6；
用多孔石墨化碳色譜柱分離，流速為100-200μL/min，洗脫梯度如下，均為體積百分比：
0～30min，100％流動(dòng)相A；30-34min，83-87％流動(dòng)相A，13-17％流動(dòng)相B；34～90min，83-87％流動(dòng)相A，13-17％流動(dòng)相B；90～100min，100％流動(dòng)相B；100～115min，100％流動(dòng)相A；進(jìn)入步驟(13)；
(12)PGC色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析：將步驟(10)脫鹽后的經(jīng)過HNO2降解的低分子肝素樣品溶于去離子水，配制成濃度為0.5～2mg/mL的待測溶液；
配制流動(dòng)相A：配制0.1-0.2％的甲酸，并用氨水調(diào)pH至5-6；
配制流動(dòng)相B：配制0.1-0.2％的甲酸，80-90％的乙腈，用氨水調(diào)pH至5-6；
用多孔石墨化碳色譜柱分離，流速為100-200μL/min，洗脫梯度如下，均為體積百分比：
0～4min，83-87％流動(dòng)相A，13-17％流動(dòng)相B；4～60min，83-87％流動(dòng)相A，13-17％流動(dòng)相B；60～70min，100％流動(dòng)相B；70～85min，100％流動(dòng)相A；進(jìn)入步驟(13)；
(13)在負(fù)離子模式下用高分辨質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測，得到高分辨質(zhì)譜圖；
(14)根據(jù)步驟(13)中獲得的高分辨質(zhì)譜圖，并按照不同結(jié)構(gòu)形式的質(zhì)荷比，得到提取離子流圖；
(15)通過質(zhì)荷比的數(shù)值確定組分分子式，解析該組分的質(zhì)譜MS/MS信息對不同組分的硫酸基團(tuán)進(jìn)行位置歸屬，確定各峰結(jié)構(gòu)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種亞硝酸降解分析低分子肝素二糖結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于，所述步驟(1)，配制肼解溶液，包括步驟如下：將硫酸肼溶解于去離子水中，再加入無水肼，配制硫酸肼濃度為1％(w/w)，肼濃度為60％(v/v)的肼解溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種亞硝酸降解分析低分子肝素二糖結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于，所述步驟(2)，在室溫下反復(fù)蒸發(fā)，直至徹底除去殘留肼，包括步驟如下：通風(fēng)櫥中通過空氣流使肼蒸發(fā)后，反復(fù)蒸發(fā)轉(zhuǎn)干，徹底除去殘留肼。
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