[發明專利]特異性示蹤內皮細胞分化的hESC指示細胞系的構建方法

有效

• 申請號: 201710894222.6
• 申請日: 2017-09-28
• 公開（公告）號: CN107805627B
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 梁德生;胡志青;鄔玲仟
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/63
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司 43113
• 代理人: 盧宏;周棟

本發明公開了一種特異性示蹤內皮細胞分化的hESC指示細胞系的構建方法，該方法包括如下步驟：(1)構建質粒CD144N?GFP；(2)構建質粒TALENs，所述質粒TALENs包括質粒CD144N?L2和質粒CD144N?R2；(3)將質粒CD144N?GFP和質粒TALENs同時核轉ESCs，經過G418篩選，挑取單克隆之后，利用跨5’同源臂引物F1/R1及跨3’同源臂引物F2/R2進行PCR初步鑒定，鑒定雙側陽性者進行Southern blot鑒定，利用Kpn I酶切，長同源臂上探針進行雜交鑒定，陽性者即為特異性示蹤內皮細胞分化的hESC指示細胞系。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及特異性示蹤內皮細胞分化的hESC指示細胞系的構建方法。

背景技術

人胚胎干細胞(ESCs)和誘導多能干細胞(iPSCs)為疾病建模，藥物篩選和許多其他體外或體內應用提供了前所未有的優勢。鑒于其獨特的治療潛力，許多研究已經制定了有效分化ESC到不同譜系細胞的方案，以避免移植未分化的ESC形成畸胎瘤。因此，建立譜系特異性報告ES/iPS細胞系對于更好地了解ES/iPS細胞的不同發育階段，分化方案的有效優化和體內監測移植細胞存活、細胞遷移將是必不可少的。

位點特異性基因打靶是構建定點整合報告基因細胞系的有效途徑。該策略依賴于目標基因組編輯和同源重組(HR)介導將外源報告基因表達框引入適當的基因組位點。這使得報告基因在內源或外源啟動子的控制下永久地定點整合至基因組特定位點，而不會產生與隨機整合相關聯的任何不利影響。然而，ESCs中HR的低效率使得在人類ESC中的基因打靶較為困難。幸運的是，位點特異性核酸酶的出現可以幫助實現有效和特異性的基因編輯。轉錄激活子樣效應核酸酶(TALENs)不僅可以設計和構建簡單，而且具有較少的脫靶效應。因此，在本文中，我們借助TALENs來構建人類ESCs指示細胞系。

由細胞功能障礙或細胞數量減少引起的內皮細胞功能障礙導致許多疾病，如心血管疾病，腎臟疾病，血友病A等。這些疾病可以通過移植功能性內皮細胞來治療。有許多研究使用功能性內皮細胞治療心血管疾病和血友病A。特別是作為X連鎖隱性先天性出血性疾病的血友病A被確定為基因治療最有吸引力的候選者之一。使用經基因修正的內皮細胞是血友病A的理想治療方法。然而，這種治療受到人類內皮細胞來源不足和自我更新能力差的阻礙。胚胎干細胞(ESCs)因其具有自我更新能力和多譜系分化潛能可以有效解除這一限制。因此，構建可以特異性示蹤內皮細胞分化的指示ESC細胞系將會發揮巨大的效用。

如上所述，目前還沒有可以用來特異性示蹤hESCs向內皮細胞分化的定點整合指示 ESC細胞系。如果把范圍擴大的話，目前構建可以指示內皮細胞的研究倒是有不少，都是使用的隨機整合策略。這種策略是一種比較粗放的方式，就是使用一個外源性克隆的內皮細胞特異性啟動子加外源報告基因質粒來轉染細胞，這個質粒包含了內皮細胞啟動子的整個編碼序列以及一個報告基因序列。整個表達框有一定幾率整合到基因組中，從而表達報告基因發揮作用。其缺點有：

a.此種策略較于原位啟動子處直接靶入報告基因無疑增加了質粒的大小，一般來說質粒越大，構建也越麻煩，整合效率也會降低。

而我們的策略最終整合的片段只有外源報告基因序列，減小了載體大小，技術上非常容易實現；

b.如果基因隨機整合到基因組中，基因的表達可能會受到位置效應的影響，有可能表達效率低，甚至不能表達。

我們的策略是原位定點添加報告基因，就是在CD144原位啟動子下游也就是起始密碼子處插入報告基因編碼序列，這樣可以在基因原有的啟動子以及調控元件下，完全指示細胞本身的實際表達情況；

c.如果質粒整合到其他內源性基因則有可能破壞內源性基因或者激活原來不表達的有害基因，從而導致不好的后果。

原位靶入報告基因策略導入的序列是精確的定點導入，不存在這種不確定性，相對安全。