[發明專利]半固體篩選培養基及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201710888365.6
• 申請日: 2017-09-27
• 公開（公告）號: CN107764789A
• 公開（公告）日: 2018-03-06
• 發明（設計）人: 尹杰
• 申請（專利權）人: 成都微康生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所11308
• 代理人: 黎昌莉

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，涉及一種半固體篩選培養基及其制備方法和應用，具體為一種時間分辨熒光半固體篩選培養基及其制備方法和應用。

背景技術

時間分辨熒光分析法(Time resolved fluoroisnmunoassay，TRFIA)是上世紀80年代提出的一種較為新型的檢測手段，是以具有獨特熒光特性的鑭系元素及其螯合劑作為示蹤物，建立的一種新型的非放射性微量分析技術。TRFIA是根據鑭系元素螯合物的發光特點，用時間分辨技術測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數進行信號分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。由于其高靈敏度，在臨床上得到了廣泛的應用，逐漸代替了放射免疫分析。

單克隆抗體技術的基本原理是將分泌抗體但不能長期培養的B細胞與能在體外長期培養的骨髓瘤細胞進行雜交，篩選得到的雜交瘤細胞既能分泌抗體又有骨髓瘤細胞無限增殖的特性，由一個雜交瘤細胞繁殖、分泌的抗體稱為單克隆抗體，它只針對一個抗原表位。細胞融合時，B細胞是從抗原免疫的動物的脾臟中分離出來的，骨髓瘤細胞是經過誘變和篩選得到的缺陷型，其本身不能分泌抗體；并且是次黃嘌呤鳥嘌呤核苷酸轉移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶激酶(TK)的缺陷型，不能在含有次黃嘌呤(hypoxanthine H)、氨基蝶呤(aminopterin,A)、胸腺嘧啶(thymidine T)的篩選培養基(HAT)中存活，HAT系次黃嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脫氧核苷(thymidin)三種物質各英文首字之綴列，HAT培養基也就是指含有這三種物質的細胞培養基。在融合后的細胞群中，未融合的脾細胞和相互融合的脾細胞，不能連續培養，只能在培養基中存活幾天，而未融合的骨髓瘤細胞和融合的骨髓瘤細胞因缺乏HGPRT不能在HAT培養基中存活，只有骨髓瘤細胞與脾細胞形成的雜交瘤細胞能在HAT培養基中存活下來，所以雜交瘤能正常地生長繁殖而被選擇出來。

一個脾臟中，能分泌抗體的細胞占的比例很少，90％以上的細胞是不能分泌抗體的。即使進行了人工免疫，能分泌出針對人工免疫的抗原的抗體的細胞比例也是很低的，并且兩個細胞的融合是隨機的，因此，盡管一個成功免疫的脾臟可達到2×10⁸個細胞以上，但細胞融合后能得到目標雜交瘤的數量也是很有限的，如何篩選克隆出這些能分泌目的抗體的雜交瘤細胞是一個非常關鍵的問題。

傳統的單抗生產過程中，細胞融合后的有價值細胞株的篩選非常繁瑣，首先ELISA檢測，檢測到有價值的細胞孔，此時該孔內的細胞不是單克隆細胞株，為了得到單克隆細胞株需要對該孔的細胞利用有限稀釋法進行亞克隆，亞克隆后細胞長起來再用ELISA進行檢測得到陽性的細胞孔，再對陽性孔進行亞克隆，再ELISA檢測，直到最終得到的細胞是由一個細胞繁殖而來的單克隆株。這個過程耗時、耗力、耗材特別嚴重，一次亞克隆周期要15天，且整個流程由于太繁瑣，使細胞培養過程中容易污染，使整個單克隆制備過程失敗。

雜交瘤細胞的克隆化是單克隆抗體制備過程中工作量最大的部分，實驗室傳統的克隆化方法為有限稀釋法，該法需要多次進行有限稀釋獲得單克隆雜交瘤，耗時較長，在克隆化之前一些不分泌抗體的雜交瘤往往生長很快，影響分泌抗體的雜交瘤細胞的生長易導致陽性克隆丟失，篩選效率較低。

除了有限稀釋法，目前也有應用HAT半固體培養基篩選克隆化細胞的方法，但目前的HAT半固體培養基存在以下幾個問題：

1.目前的半固體培養基篩選過程中并不能保證產生的克隆是由單細胞而來；

2.目前的半固體培養基篩選過程中用熒光素標記抗原篩選的方法雖然一定程度上提高了篩選效率，縮短了篩選時間，但是其中細胞、尤其是克隆化后的細胞其自身熒光背景會對篩選造成很大干擾，易造成假陽性，使篩選效率大大降低。

因此需要開發一種篩選周期短、篩選效率高、假陽性率低的篩選培養基。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種具有時間分辨熒光特性的半固體篩選培養基，該半固體篩選培養基能大大縮短篩選時間，極大降低背景熒光的假陽性，使得篩選成功率大大提高。

為實現上述目的，本發明的技術方案為：

半固體篩選培養基，包括如下體積份數的組分：