[發明專利]3D數字PCR檢測EGFR特定基因突變的引物探針組合物、試劑盒及方法

有效

• 申請號: 201710888203.2
• 申請日: 2017-09-26
• 公開（公告）號: CN107488728B
• 公開（公告）日: 2020-10-16
• 發明（設計）人: 閆慧婷;蔡暢;王海波
• 申請（專利權）人: 無錫臻和生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 韓建偉;金田蘊

本發明公開了一種3D數字PCR檢測EGFR特定基因突變的引物探針組合物、試劑盒及方法。其中，該引物探針組合物包括：檢測EGFR基因19～21號外顯子特定突變的引物及探針，突變為EGFR T790M、EGFR L858R、EGFR 2235_2249del15和EGFR 2236_2250del15。應用本發明的3D?PCR檢測EGFR特定基因突變的引物探針組合物，包含了與肺癌相關的4個常見突變位點，根據不同突變位點設計的引物及探針分別對各突變位點進行檢測，不僅能檢測多種突變，檢測效率高，而且將其結合3D?PCR的檢測方法進行檢測，使得結果更加直觀清晰。

技術領域

本發明涉及3D-PCR檢測領域，具體而言，涉及一種3D數字PCR檢測EGFR特定基因突變的引物探針組合物、試劑盒及方法。

背景技術

國際癌癥研究中心(IARC)預計，癌癥發病人數將會以每年3％～5％的速度遞增，并有調查研究顯示中低收入國家癌癥的發病率遠高于發達國家，預計在2020年全球將有2000萬新發病例的產生，死亡病例將達1200萬。所以各國對癌癥采取的預防措施刻不容緩。每年我國用于癌癥病人的醫療支出高達800億元，約占衛生總支出的20％，遠高于其他慢性病的醫療費用。近些年來，我國癌癥的發病率逐年提高，尤其是肺癌發病率逐年上升。研究顯示，肺癌發病率居癌癥發病率首位，并有相關報道顯示：全球肺癌新發病例約為161萬例，死亡約138萬例，約占惡性腫瘤新發病例及死亡病例的13％及18％，居惡性腫瘤第一位。盡管肺癌的診斷方法和治療手段不斷提高，但肺癌的死亡率仍未得到有效控制，患者的預后較差，5年生存率仍＜20％。

研究顯示：癌癥相關基因出現異常導致腫瘤細胞逃避凋亡、無限復制、血管生成、侵襲及轉移和免疫逃逸等現象的出現。傳統的腫瘤治療主要針對細胞DNA，這種傳統治療的方法往往缺乏特異性，在殺死腫瘤細胞的同時，一些正常的細胞也被錯殺。近些年來，腫瘤的診斷方法和治療手段不斷提高，尤其是靶向治療的出現，使腫瘤的死亡率得到了有效的控制。靶向治療具有高選擇性和低毒性等優點，可以長期指導臨床用藥，其作用機理是針對腫瘤細胞特有的靶點設計結合藥物，避免了傳統治療方法的缺點，從而達到抑制腫瘤細胞分裂增殖的作用，對患者而言不僅延長了患者的生存時間還改善了患者的生存質量。

研究表明，EGFR基因突變主要發生在第19～21號外顯子，包括第19號外顯子的缺失突變，第20號外顯子的片段插入和第21號外顯子的點突變，約占EGFR基因突變的90％。第19號外顯子的缺失導致EGFR蛋白中氨基酸序列丟失，從而改變了細胞對TKIs的敏感性；引起耐藥的主要原因是第20號外顯子第790位密碼子(核苷酸位置2669堿基替換)出現T-M轉換突變；第21號外顯子的點突變主要是第858位密碼子出現T-G轉換，使該位點的亮氨酸轉變為精氨酸，簡稱為L858R。

目前，檢測基因變異的技術主要有直接測序法(亦稱Sanger測序法)和ARMS法，方法簡介于下：

Sanger測序法，即Sanger(桑格)雙脫氧鏈終止法。其基本原理為每個反應含有所有四種脫氧核苷酸(dNTP)使之擴增，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷酸(ddNTP)使之終止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3’-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止，終止點由反應中相應的雙脫氧核苷酸而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整，使反應得到一組長幾個至千以上個，相差一個堿基一系列片斷。它們具有共同的起始點，但終止在不同的位置上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。將雙脫氧核糖核苷酸進行不同熒光標記，并將PCR反應獲得的總DNA通過毛細管電泳分離，由于ddATP，ddGTP，ddCTP，ddTTP(4種雙脫氧核糖核苷酸)熒光標記不同，計算機即可根據顏色判斷在這個位置上堿基究竟是哪一個(A、T、G、C)。