[發明專利]一種用于鑒定煙草對南方根結線蟲抗性的瞬時表達載體

在審

• 申請號: 201710887458.7
• 申請日: 2017-09-27
• 公開（公告）號: CN107619834A
• 公開（公告）日: 2018-01-23
• 發明（設計）人: 徐世曉;薛剛;楊鐵釗;李曉輝;王袁
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66
• 代理公司: 鄭州紅元帥專利代理事務所(普通合伙)41117
• 代理人: 楊妙琴

技術領域

本發明屬于微生物基因工程技術領域，具體涉及一種用于鑒定煙草對南方根結線蟲抗性的瞬時表達載體。

背景技術

煙草根結線蟲病是世界煙葉生產中的主要病害之一。由于殺線劑農藥(鐵滅可等)的限制應用，抗病品種的利用已成為防治根結線蟲病最有效的措施。我國煙草抗根結線蟲病的育種還很薄弱，主要是應用美國抗根結線蟲病的烤煙品種為親本，開展兼抗性育種，因此具有抗根結線蟲病特性的育成品種其抗性不高，在整個烤煙育種中始終沒有針對煙草抗根結線蟲病開展育種研究，其主要原因是傳統的抗性鑒定技術難于適應大量育種材料鑒定的需求，且鑒定結果受環境影響較大，準確性不高，限制了煙草抗根結線蟲病育種的開展。

1963年，美國人在抗南方根結線蟲品種葉片上發現了一種嚴重的葉脈壞死病斑，經過鑒定將其確定為PVY-MSNR新的株系。國外研究人員通過人工接種PVY-MSNR，在抗南方根結線蟲品種葉片上引起過敏性壞死反應(枯斑反應)，而在感病品種上未出現癥狀，以此來篩選抗線蟲品種。把這項技術用于煙草抗病育種程序中，能夠極大地縮短育種年限。

農桿菌介導的瞬時表達技術是目前研究基因功能的常用方法。瞬時表達技術可以實現目的基因短暫的高水平表達，與穩定遺傳表達相比，具有操作簡便、所需時間短、耗資少、且不受遺傳轉化難易的影響等優點。

發明內容

為解決傳統的抗性鑒定技術難于適應大量育種材料鑒定的需求，且鑒定結果受環境影響較大，準確性不高的技術問題，本發明結合背景技術中的理論構建農桿菌瞬時表達載體，用于快速鑒定煙草根結線蟲的抗性。同時，利用煙草抗根結線蟲病基因鑒定技術在雜種分離世代輔助選擇，并應用到煙草抗根結線蟲病品種選育程序中，加速育種進程。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案為：

一種用于鑒定煙草對南方根結線蟲抗性的瞬時表達載體，是由SEQ ID NO.1所示序列通過5’Pstl和3’Sacl克隆至載體pCAMBIA2300-LIC獲得。

一種所述用于鑒定煙草對南方根結線蟲抗性的瞬時表達載體的構建方法，包括以下步驟：

(1)人工合成病毒PVY-NIB的CDNA片段：在PVY-NIB的CDNA片段序列中5’端加入克隆位點Pstl和3’端加入克隆位點Sacl，加入克隆位點后的序列為SEQ ID NO.1；

(2)pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB瞬時表達載體構建：將pCAMBIA2300-LIC空載體進行雙酶切，并通過T4DNA連接酶將空載體pCAMBIA2300-LIC和步驟(1)中的加入克隆位點后人工合成的PVY-NIB的CDNA片段進行連接，構建pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB瞬時表達載體。

與現有技術相比，本發明的有益效果為：

(1)本發明通過人工合成PVY-MSNR株系復制酶基因PVY-NIB，以pCAMBIA2300-LIC為植物表達載體，構建農桿菌瞬時表達載體，建立新的煙草抗根結線蟲病品種基因鑒定技術體系。實現簡單、準確、快速、高通量的對煙草抗根結線蟲的抗性篩選鑒定。

(2)本發明建立的新的瞬時表達載體用于煙草抗南方根結線蟲育種程序中，能夠極大地縮短育種年限。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。

一種用于鑒定煙草對南方根結線蟲抗性的瞬時表達載體，是由SEQ ID NO.1所示序列通過5’Pstl和3’Sacl克隆至載體pCAMBIA2300-LIC獲得。

一種所述用于鑒定煙草對南方根結線蟲抗性的瞬時表達載體的構建方法，包括以下步驟：

(1)人工合成病毒PVY-NIB的CDNA片段：在PVY-NIB的CDNA片段序列中5’端加入克隆位點Pstl和3’端加入克隆位點Sacl，加入克隆位點后的序列為SEQ ID NO.1；

(2)pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB瞬時表達載體構建：將pCAMBIA2300-LIC空載體進行雙酶切，并通過T4DNA連接酶將空載體pCAMBIA2300-LIC和步驟(1)中的加入克隆位點后人工合成的PVY-NIB的CDNA片段進行連接，構建pCAMBIA2300-LIC:PVY-NIB瞬時表達載體。

本發明中，植物表達載體pCAMBIA2300-LIC由韓國首爾大學Kim教授提供，載體大小約10490bp，載體抗性為Kan。

實施例1

一種所述用于鑒定煙草對南方根結線蟲抗性的瞬時表達載體的構建方法，包括以下步驟：