[發明專利]一種從腫瘤細胞上清液中分離外泌體的方法

在審

• 申請號: 201710885748.8
• 申請日: 2017-09-18
• 公開（公告）號: CN108148809A
• 公開（公告）日: 2018-06-12
• 發明（設計）人: 王學習;馬占軍;路莉;胡燕;崔雪;陳果湖;楊洋
• 申請（專利權）人: 蘭州大學
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種從腫瘤細胞上清液中分離外泌體的方法，包括如下步驟：當腫瘤細胞生長匯合率達85％?95％時，收集培養基，獲取細胞培養上清液，進行膜過濾后，收集濾液再將濾液超濾離心，收集離心超濾液，按超濾液體積1∶1比例加入10w/v％?12w/v％聚乙?醇溶液，并充分混勻后4℃離心，最后所得沉淀即為外泌體。本發明取材方便，易于富集擴增培養；分離過程中采用膜過濾、超濾離心和加入聚乙二醇溶液等手段有效增加外泌體富集，耗時短，成本低。

技術領域

本發明涉及一種用于從生物流體中分離外泌體的方法，具體涉及一種從腫瘤細胞上清液中分離外泌體的方法。

背景技術

外泌體(exosomes)是一種由多種細胞所分泌的、直徑為30-140nm的亞細胞囊泡結構，電子顯微鏡下呈球狀或杯狀。其源于細胞內的早期胞內體(early endosome)，胞內體向內出芽形成多囊泡胞內體(multivesicular endosome，MVE)，后者與細胞膜融合從而將小囊泡釋放到細胞外，形成外泌體。外泌體的組分分析表明，外泌體中包含大量的蛋白質、核酸和脂質等，其中一部分是所有外泌體所共有的普遍性組分，其余則是因外泌體來源組織不同而特有的組分。無論是哪種成分，在外泌體介導的細胞間物質、信息交流的過程中均起到關鍵作用。研究發現，外泌體內含有與細胞來源相關的蛋白質、RNA和microRNA，并且外泌體能夠通過生物屏障，在細胞間傳遞功能性核酸分子，從而發揮各種生物學功能，如腫瘤細胞源外泌體可通過多種途徑參與腫瘤微環境中腫瘤細胞與腫瘤微環境之間相互作用，進而促進腫瘤細胞的生長和轉移。故外泌體有望成為一種新型給藥途徑及基因治療載體。

腫瘤是目前僅次于心腦血管疾病而影響人類健康的一大殺手，局部的浸潤和遠距離的轉移是惡性腫瘤最重要的特點，并且這也是腫瘤致人死亡的主要原因。大量研究發現，與正常細胞相比，腫瘤細胞釋放更多的外泌體來調節腫瘤微環境，逃避免疫系統的殺傷，增強腫瘤細胞的耐藥性。近年來，隨著對外泌體功能研究的深入，在腫瘤來源的外泌體中發現了一系列在促進腫瘤的浸潤和轉移過程中起到了關鍵作用的蛋白質和miRNAs。同時，這一發現也為開發腫瘤診斷與治療的新方法提供了重要的理論基礎。

目前，外泌體的提取主要采用超高速梯度離心法、密度梯度超速離心法、超速離心-免疫磁珠親和法、以及試劑盒離心柱方法等。超高速離心法采用超高速離心機，價格昂貴，通常采用不低于100,000×g離心5-8h，對耗材的要求高，而且耗時很長。免疫磁珠親和法可以對提取的外泌體進行特異性標記的純化，但是由于目前對于不同來源的外泌體的標記蛋白還不明確，所以獲得的外泌體產量遠低于超速離心的產量，并往往需要多種標記的免疫磁珠進行提取，提高了試劑成本。試劑盒離心柱通常只適用于較小量外泌體的獲得，并且成本昂貴。因此，分離得到質量可靠和高富集度的外泌體仍是該研究領域目前的一項重大挑戰。

發明內容

本發明的目的在于提供一種更高效、簡易、價廉的外泌體提取方法，從而克服絕大多數研究者因實驗條件限制而無法提取獲得量質俱佳外泌體的狀況，該發明能夠從腫瘤細胞上清液中獲得高純度、高產量的外泌體，對外泌體在科學研究和臨床檢測中的推廣發揮重要的作用。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：

一種從腫瘤細胞上清液中分離外泌體的方法，包括以下步驟：

S1：用完全培養基培養腫瘤細胞，當細胞生長密度達到50％-90％時，換用無外泌體血清的培養基，培養24h-48h后，收集細胞上清液，0℃-4℃條件下，依次500-1000×g和1500-2500×g各離心15min以去除細胞或細胞碎片，收集上清液；

S2：將所得的上清液用無菌過濾器過濾，收集濾液，在0℃-4℃條件下，將所得濾液2000-4000×g離心15min，收集上清液；

S3：將步驟S2得到的上清液轉移至超濾離心管，在0℃-4℃條件下，3000-5000×g離心30min，收集超濾液；