[發(fā)明專利]一種自組裝硅質(zhì)體靜電紡絲纖維膜固定化細(xì)胞生產(chǎn)靈芝酸的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710881444.4
• 申請(qǐng)日: 2017-09-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107475345B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-01-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 湯佳鵬;葛彥;朱俐
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南通大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P33/00
• 分類號(hào): C12P33/00;C12N11/10;C12N11/08
• 代理公司: 32237 江蘇圣典律師事務(wù)所
• 代理人: 胡建華

本發(fā)明公開(kāi)了一種自組裝硅質(zhì)體靜電紡絲纖維膜固定化細(xì)胞生產(chǎn)靈芝酸的方法，包括利用靜電自組裝法將靈芝靈芝原生質(zhì)體包裹在有機(jī)?無(wú)機(jī)復(fù)合脂質(zhì)形成的穩(wěn)定硅質(zhì)體中；將殼聚糖、聚乙烯醇和聚氧化乙烯完全溶解于乙酸溶液，加入甘油，再加入硅質(zhì)體，通過(guò)靜電紡絲制得納米纖維膜，將其成卷裝入層析柱中；配制乳糖乳糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和酵母粉的混合溶液，經(jīng)過(guò)濾除菌后，以一定流速流經(jīng)層析柱，同時(shí)層析柱下部通氣，經(jīng)檢測(cè)流出液中含有靈芝酸。本發(fā)明固定化細(xì)胞的方法具有高效、抗染菌、產(chǎn)率高、產(chǎn)物濃度高的特點(diǎn)，便于后續(xù)產(chǎn)物分離和純化。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種自組裝硅質(zhì)體靜電紡絲纖維膜固定化細(xì)胞生產(chǎn)靈芝酸的方法，屬于生物化工領(lǐng)域。

背景技術(shù)

靈芝酸是靈芝中含有羧基的三萜類化合物的總稱，它分為四環(huán)三萜和五環(huán)三萜。這類物質(zhì)具有抗病毒、護(hù)肝、降血壓、降低膽固醇、抑制血小板凝聚,對(duì)組胺釋放有抑制作用，鎮(zhèn)痛作用，免疫調(diào)節(jié)，抗腫瘤，抑制真核細(xì)胞DNA多聚酶活性，抑制法尼基蛋白轉(zhuǎn)移酶活性，抗補(bǔ)體活性等多種功效。利用現(xiàn)代生物技術(shù)通過(guò)液體發(fā)酵生產(chǎn)靈芝菌絲體，菌絲增殖速度快，生產(chǎn)周期短，不受季節(jié)的影響，生產(chǎn)效率高，可實(shí)現(xiàn)靈芝的工業(yè)化生產(chǎn)。但是生產(chǎn)周期長(zhǎng)，產(chǎn)量低，限制了靈芝酸在食品、保健品和醫(yī)藥上的應(yīng)用。

硅質(zhì)體是一種類脂質(zhì)體，是由一個(gè)分子連接兩個(gè)疏水性的碳鏈和一個(gè)親水性的有機(jī)硅烷分子組成的新型脂質(zhì)分子，這種分子在水中通過(guò)自組裝過(guò)程形成囊泡，囊泡表面覆蓋有納米級(jí)厚度的無(wú)機(jī)硅酸鹽殼層，用穩(wěn)定的Si-C鍵將無(wú)機(jī)層和有機(jī)層二分子體連接在一起。硅質(zhì)體與傳統(tǒng)的脂質(zhì)體囊泡相比，是一種非常穩(wěn)定的囊泡結(jié)構(gòu)，是有機(jī)-無(wú)機(jī)的雜化材料。與傳統(tǒng)的常規(guī)脂質(zhì)體相比，硅質(zhì)體表面的硅氧烷網(wǎng)絡(luò)顯著增加了脂質(zhì)體及固定化細(xì)胞的穩(wěn)定性，對(duì)表面活性劑、酸堿都有很好的耐受性。硅質(zhì)體作為固定化細(xì)胞的載體，與其他常規(guī)載體相比，可以一個(gè)硅質(zhì)體就裝載一個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞被束縛在硅質(zhì)體內(nèi)，獲得極大的機(jī)械強(qiáng)度，極大的比表面積和抗污染能力。

靜電紡絲納米纖維膜比常規(guī)的固定化載體，具有孔隙率高，比表面積大，孔洞連通性好的特點(diǎn)，能夠降低底物的擴(kuò)散阻力，有利于提高固定化細(xì)胞的反應(yīng)活性。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有高效、抗染菌、產(chǎn)率高、產(chǎn)物濃度高的固定化細(xì)胞方法生產(chǎn)靈芝酸，并便于后續(xù)產(chǎn)物分離和純化。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了一種自組裝硅質(zhì)體靜電紡絲纖維膜固定化細(xì)胞生產(chǎn)靈芝酸的方法，包括如下步驟：

步驟一：制備靈芝原生質(zhì)體硅質(zhì)體：稱取質(zhì)量比為0.1～0.2:1～3的有機(jī)-無(wú)機(jī)復(fù)合脂質(zhì)與靈芝原生質(zhì)體，優(yōu)選0.15:2；將有機(jī)-無(wú)機(jī)復(fù)合脂質(zhì)溶于三氯甲烷中，蒸發(fā)除去三氯甲烷得到類脂質(zhì)薄膜；靈芝原生質(zhì)體懸浮于甘露醇水溶液中，然后加入到所得類脂質(zhì)薄膜中，攪拌混勻并迅速加熱到45～50℃，優(yōu)選48℃，熱激10～30s同時(shí)水浴超聲，冷卻至4℃后靜置，經(jīng)脂質(zhì)體擠出器擠出，得到粒徑均一的靈芝原生質(zhì)體硅質(zhì)體懸液；

步驟二：制備納米纖維膜：取殼聚糖、聚乙烯醇和聚氧化乙烯溶解于乙酸水溶液中，加入甘油，再加入步驟一制得的靈芝原生質(zhì)體硅質(zhì)體懸液，攪拌混勻，通過(guò)靜電紡絲制得納米纖維膜，將其成卷填入層析柱中，層析柱中心留空，用于無(wú)菌空氣通過(guò)；

步驟三：配制乳糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和酵母粉的混合水溶液，經(jīng)過(guò)濾除菌后，流經(jīng)步驟二制備的層析柱，收集流出液，即得。

步驟一中，所述靈芝原生質(zhì)體通過(guò)如下步驟獲得：

步驟a：取靈芝菌體用無(wú)菌水充分洗滌，離心取沉淀；

步驟b：配制酶解液：分別取步驟a沉淀質(zhì)量2～4％的溶壁酶、蝸牛酶、纖維素酶和崩潰酶，以質(zhì)量體積比0.1:5～10g/mL加入到含有0.3～0.5mol/L KCl和0.2～0.4mol/LMgSO₄的水溶液中，攪拌充分溶解，再經(jīng)過(guò)濾除菌，制得酶解液；