[發明專利]一種自組裝硅質體靜電紡絲纖維膜固定化細胞生產靈芝酸的方法

有效

• 申請號: 201710881444.4
• 申請日: 2017-09-26
• 公開（公告）號: CN107475345B
• 公開（公告）日: 2020-01-14
• 發明（設計）人: 湯佳鵬;葛彥;朱俐
• 申請（專利權）人: 南通大學
• 主分類號: C12P33/00
• 分類號: C12P33/00;C12N11/10;C12N11/08
• 代理公司: 32237 江蘇圣典律師事務所
• 代理人: 胡建華

1.一種自組裝硅質體靜電紡絲纖維膜固定化細胞生產靈芝酸的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一：制備靈芝原生質體硅質體：稱取質量比為0.1～0.2:1～3的有機-無機復合脂質與靈芝原生質體；將有機-無機復合脂質溶于三氯甲烷中，蒸發除去三氯甲烷得到類脂質薄膜；靈芝原生質體懸浮于甘露醇水溶液中，然后加入到所得類脂質薄膜中，攪拌混勻并迅速加熱到45～50℃，熱激10～30s同時水浴超聲，冷卻至4℃后靜置，經脂質體擠出器擠出，得到靈芝原生質體硅質體懸液；

步驟二：制備納米纖維膜：取殼聚糖、聚乙烯醇和聚氧化乙烯溶解于乙酸水溶液中，加入甘油，再加入步驟一制得的靈芝原生質體硅質體懸液，攪拌混勻，通過靜電紡絲制得納米纖維膜，將其成卷填入層析柱中，層析柱中心留空；

步驟三：配制乳糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和酵母粉的混合水溶液，經過濾除菌后，流經步驟二制備的層析柱，收集流出液，即得；

步驟一中，所述靈芝原生質體通過如下步驟獲得：

步驟a：取靈芝菌體用無菌水洗滌，離心取沉淀；

步驟b：配制酶解液：分別取步驟a沉淀質量2～4％的溶壁酶、蝸牛酶、纖維素酶和崩潰酶，以質量體積比0.1:5～10g/mL加入到含有0.3～0.5mol/L KCl和0.2～0.4mol/L MgSO₄的水溶液中，攪拌溶解，再經過濾除菌，制得酶解液；

步驟c：將步驟a得到的沉淀加入到步驟b得到的酶解液中，渦旋混勻，25～30℃下水浴酶解3～8h后，離心取沉淀即得靈芝原生質體；

步驟一中，所述有機-無機復合脂質的結構式如下：

所述有機-無機復合脂質與三氯甲烷混合的質量體積比為100～200:10mg/mL；所述甘露醇水溶液的濃度為100～180g/L，靈芝原生質體與甘露醇水溶液混合的質量體積比為1～3:10g/mL；

所述脂質體擠出器采用聚碳酸酯濾膜，濾膜的孔徑為0.5～1.0μm。

2.根據權利要求1所述的生產靈芝酸的方法，其特征在于，步驟二中，所述殼聚糖的粘均分子量為5.0×10⁵，脫乙酰度為80～85％；所述聚乙烯醇重均分子量為180000～200000；所述聚氧化乙烯重均分子量為1×10⁶～1×10⁷；所述乙酸水溶液體積濃度為1～2％；所述殼聚糖、聚乙烯醇和聚氧化乙烯的質量比為1～2:2～4:7～9，以總的質量濃度1.5～2％溶解于乙酸水溶液中。

3.根據權利要求1所述的生產靈芝酸的方法，其特征在于，步驟二中，所述甘油的加入量與乙酸水溶液的質量體積比為1～2g/L；所述靈芝原生質體硅質體懸液的加入量與乙酸水溶液的體積比為1:100～500。

4.根據權利要求1所述的生產靈芝酸的方法，其特征在于，步驟二中，所述靜電紡絲的接收裝置采用鋁箔，噴頭到接收裝置的距離為5～30cm，電壓為3～30KV，噴射流量為1～5mL/h。

5.根據權利要求1所述的生產靈芝酸的方法，其特征在于，步驟三中，所述混合水溶液中乳糖濃度為10～15g/L，磷酸二氫鉀濃度為0.5～1g/L，硫酸鎂濃度為0.5～0.8g/L，酵母粉濃度為5～8g/L；所述混合水溶液的pH值調至5.0～5.8。

6.根據權利要求1所述的生產靈芝酸的方法，其特征在于，步驟三中，所述混合水溶液的流速為0.2～0.5mL/h；層析柱中無菌空氣的通氣量為1.0～2.0V/V·min，層析柱夾套溫度控制在27～32℃。