[發明專利]一種檢測人及動物血清抗SFTS抗體的膠體金免疫層析試紙條

在審

• 申請號: 201710874451.1
• 申請日: 2017-09-25
• 公開（公告）號: CN107727848A
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發明（設計）人: 余福勛;聶瑛潔;羅振華;蔣立;黃學勇;許汴利
• 申請（專利權）人: 貴州省人民醫院
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/532
• 代理公司: 北京棧橋知識產權代理事務所(普通合伙)11670
• 代理人: 潘衛鋒

1.一種檢測人及動物血清抗SFTS抗體的膠體金免疫層析試紙條，其特征在于，所述試紙條含有：膠體金標記的特異性SFTS重組抗原的玻璃纖維膜、包被有特異性SFTS重組抗原的檢測線和包被有鼠抗-SFTS重組抗原單克隆抗體的質控線的硝酸纖維素膜；待測樣本中的抗SFTS抗體先與膠體金標記SFTS重組抗原反應，然后硝酸纖維素膜上對應的特異性SFTS重組抗原反應，形成特異性SFTS重組抗原-特異性SFTS抗體-膠體金標記SFTS重組抗原夾心復合物，通過膠體金顆粒特有的顏色示蹤而判斷特異性抗體的有無。

2.根據權利要求1所述的一種檢測人及動物血清抗SFTS抗體的膠體金免疫層析試紙條，其特征在于，所述特異性SFTS重組抗原的制備方法為：

(1)分離得到SFTS病毒的病毒株，用RNA提取試劑提取出SFTS病毒的RNA；

(2)以SFTS病毒株的基因組為模板，通過PCR擴增得到N蛋白基因產物；

(3)用內切酶Sph I和HindⅢ酶切處理在目的基因兩側帶有限制性內切酶Sph I和HindⅢ識別位點的所述SFTS病毒株N蛋白基因PCR產物，與經相同酶切處理的表達載體pQE 30連接，構建重組表達質粒，轉化大腸桿菌的感受態細胞，得到陽性克隆重組質粒；用終濃度0.3mmol/L的IPTG進行誘導表達，表達產物經純化后即獲得特異性SFTS重組抗原。

3.一種如權利要求1至2任意一項所述的一種檢測人及動物血清抗SFTS抗體的膠體金免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于，該方法包括下述步驟：

S1、制備膠體金標記的特異性SFTS重組抗原的玻璃纖維膜：

(1)膠體金溶液的制備：

用王水浸泡容器一定時間，然后用超純水清洗干凈，烘干；取1％氯金酸1mL加入到去離子雙蒸水中至終體積為100mL，得到的氯金酸濃度為0.01％，將得到的氯金酸加熱至沸騰，磁力加熱攪拌下加入1％檸檬酸三鈉水溶液2.0mL，繼續加熱直至溶液呈葡萄酒色為止，冷卻后置于棕色瓶中4℃冰箱保存備用；

(2)金標特異性SFTS重組抗原的制備：

取上述制備的膠體金溶液，用0.1mol/L NaOH調節pH至6.0-8.5；用磷酸鹽緩沖液(PB)將特異性SFTS重組抗原的稀釋至抗原濃度為0.3-1.0mg/mL；取所述稀釋液，在4℃條件下2400r/min離心28min，吸取上清液，棄去沉淀，邊攪拌邊將上清液逐滴加入到上述調節好pH的膠體金溶液中，靜置；加入穩定劑，在4℃條件下2400r/min離心28min，靜置,棄上清，留沉淀物，用緩釋劑重懸，即得到膠體金標記的特異性SFTS重組抗原；

(3)將標記好膠體金的特異性SFTS重組抗原溶液均勻涂布到已經處理好的玻璃纖維素膜上，冷凍干燥，制備成膠體金墊，備用；

S2、制備包被有特異性SFTS重組抗原的檢測線和包被有鼠抗-特異性SFTS重組抗原單克隆抗體的質控線的硝酸纖維素膜：

將特異性SFTS重組抗原稀釋成1mg/mL，將鼠抗-特異性SFTS重組抗原單克隆抗體稀釋成1mg/mL；將稀釋好的特異性SFTS重組抗原均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到檢測線；將稀釋好的鼠抗-特異性SFTS重組抗原單克隆抗體均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到質控線，室溫包被過夜，封袋備用；

S3、制備試紙條：

將樣品墊在封閉液中浸泡40min，烘干，封裝備用；將PVC底板、硝酸纖維素膜檢測層、樣品墊、玻璃纖維素膜和吸水墊組合，PVC底板上硝酸纖維素膜的上方粘帖吸水紙，硝酸纖維素膜與吸水紙相互交疊0.2mm，在硝酸纖維素膜的下方依次粘貼玻璃纖維膜和樣品墊，硝酸纖維素膜和玻璃纖維膜之間以及玻璃纖維膜與樣品墊之間相互交疊0.2mm，即得所述檢測人及動物血清抗SFTS抗體的膠體金免疫層析試紙條。

4.根據權利要求3所述的一種檢測人及動物血清抗SFTS抗體的膠體金免疫層析試紙條，其特征在于，所述膠體金標記特異性SFTS重組抗原用pH調節劑調節pH值為6.0-8.5，所述的玻璃纖維素膜上的膠體金標記特異性SFTS重組抗原的含量為0.05～0.2μg/cm²。