[發(fā)明專利]一種檢測人及動物血清抗SFTS抗體的膠體金免疫層析試紙條

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710874451.1
• 申請日: 2017-09-25
• 公開（公告）號: CN107727848A
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 余福勛;聶瑛潔;羅振華;蔣立;黃學(xué)勇;許汴利
• 申請（專利權(quán)）人: 貴州省人民醫(yī)院
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/532
• 代理公司: 北京棧橋知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11670
• 代理人: 潘衛(wèi)鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種檢測人及動物血清抗SFTS抗體的膠體金免疫層析試紙條。

背景技術(shù)

新布尼亞病毒(Novel Bunyavirus，SFTS Bunyavirus)，是發(fā)熱伴血小板減少綜合癥(Fever with Throbocytopenia Associated syndrome，SFTS)的病原，為布尼亞病毒科白蛉熱病毒屬的一種新型病毒，于2009年在中國首先發(fā)現(xiàn)，也是中國首例發(fā)現(xiàn)的新型病毒。是威脅我國人民健康和公共衛(wèi)生安全的重要新發(fā)傳染病，其臨床表現(xiàn)以發(fā)熱伴血小板、白細(xì)胞減少和消化道癥狀為主要特征，重癥死亡率高達(dá)15～30％，嚴(yán)重影響著人民的健康和生命安全。到目前為止，全國已有河南、江蘇、湖北、山東、安徽和遼寧等26個省發(fā)現(xiàn)病例，每年有數(shù)千病例,造成數(shù)百人死亡。中國國家疾控中心、河南省疾控中心、江蘇省疾控中心等單位先后成功的分離到該病病毒，并對其進(jìn)行了病原學(xué)、流行病學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等研究。目前該病毒序列已經(jīng)闡明，但是對SFTS尚無特效藥治療和疫苗預(yù)防。

SFTS很容易與血液、消化、呼吸等多系統(tǒng)疾病相混淆，加上臨床醫(yī)生對其缺乏認(rèn)知，給該病的診斷和鑒別診斷帶來困難。該病毒需要通過實驗室手段進(jìn)行確診，常用的方法有病毒分離培養(yǎng)、病毒核酸檢測和免疫學(xué)檢測等。病毒分離和免疫學(xué)檢測或是操作復(fù)雜、費時，不能快速得到檢測結(jié)果，或是檢測敏感度不夠。

當(dāng)前，基于PCR技術(shù)(常規(guī)PCR或熒光定量PCR)對病毒核酸進(jìn)行檢測是對SFTS進(jìn)行早期快速診斷的重要手段。PCR技術(shù)具有檢測敏感性高，操作簡單、快速等優(yōu)點，然而其前期投入費用較大(對實驗室功能分區(qū)以及PCR儀的依賴)，而且易受實驗室污染而導(dǎo)致假陽性，加上SFTS為人獸共患自然疫源性疾病，多發(fā)生于山區(qū)和丘陵等醫(yī)療衛(wèi)生條件相對較差的地區(qū)，所以，亟待建立一種快速、可靠的，適合基層單位和現(xiàn)場應(yīng)用的SFTS病毒檢測技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有的新布尼亞病毒檢測技術(shù)不符合快速、簡便、高靈敏度的要求，進(jìn)而提供一種檢測人及動物血清抗SFTS抗體的膠體金免疫層析試紙條。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種檢測人及動物血清抗SFTS抗體的膠體金免疫層析試紙條，所述試紙條含有：膠體金標(biāo)記的特異性SFTS重組抗原的玻璃纖維膜、包被有特異性SFTS重組抗原的檢測線和包被有鼠抗-特異性SFTS重組抗原單克隆抗體的質(zhì)控線的硝酸纖維素膜；待測樣本中的抗SFTS抗體先與膠體金標(biāo)記特異性SFTS重組抗原反應(yīng)，然后與硝酸纖維素膜上對應(yīng)的特異性SFTS重組抗原反應(yīng)，形成特異性SFTS重組抗原-特異性SFTS抗體-膠體金標(biāo)記特異性SFTS重組抗原夾心復(fù)合物，通過膠體金顆粒特有的顏色示蹤而判斷特異性抗體的有無。

進(jìn)一步地，所述特異性SFTS重組抗原的制備方法為：

(1)分離得到SFTS病毒的病毒株，用RNA提取試劑提取出SFTS病毒的RNA；

(2)以SFTS病毒株的基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增得到N蛋白基因產(chǎn)物；

(3)用內(nèi)切酶Sph I和Hind Ⅲ酶切處理在目的基因兩側(cè)帶有限制性內(nèi)切酶Sph I和Hind Ⅲ識別位點的所述SFTS病毒株N蛋白基因PCR產(chǎn)物，與經(jīng)相同酶切處理的表達(dá)載體pQE 30連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞，得到陽性克隆重組質(zhì)粒；用終濃度0.3mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后即獲得特異性SFTS重組抗原。

進(jìn)一步地，所述的RNA提取試劑的組成成分為：質(zhì)量濃度為0.6-0.8％的溴化鈉、質(zhì)量濃度為0.2-0.5％的硫氰酸胍、質(zhì)量濃度為0.1-0.2％的四氯化碳、質(zhì)量濃度為1.2-1.4％的乙酸乙酯、質(zhì)量濃度為0.2-0.5％的2-乙氧基乙醇、質(zhì)量濃度為0.05-0.15％的Triton X-100，余量為DEPC-H₂O。

進(jìn)一步地，所述的一種檢測人及動物血清抗SFTS抗體的膠體金免疫層析試紙條的制備方法包括下述步驟：

S1、制備膠體金標(biāo)記的特異性SFTS重組抗原的玻璃纖維膜：

(1)膠體金溶液的制備：

用王水浸泡容器一定時間，然后用超純水清洗干凈，烘干；取1％氯金酸1mL加入到去離子雙蒸水中至終體積為100mL，得到的氯金酸濃度為0.01％，將得到的氯金酸加熱至沸騰，磁力加熱攪拌下加入1％檸檬酸三鈉水溶液2.0mL，繼續(xù)加熱直至溶液呈葡萄酒色為止，冷卻后置于棕色瓶中4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

(2)金標(biāo)特異性SFTS重組抗原的制備：