[發明專利]一種稻瘟病的生物防治方法

在審

• 申請號: 201710873279.8
• 申請日: 2017-09-25
• 公開（公告）號: CN107964515A
• 公開（公告）日: 2018-04-27
• 發明（設計）人: 章云;張貝尼
• 申請（專利權）人: 安徽省中日農業環保科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P21/00;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;A01N63/02;A01N63/00;A01P21/00;A01P3/00;A01C1/00;A01G22/22;C12R1/07
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所11308
• 代理人: 范奇

技術領域

本發明涉及水稻病蟲害的生物防治技術領域，具體涉及一種稻瘟病的生物防治方法。

背景技術

水稻是中國第一大糧食作物，其產量占中國糧食產量的40％左右。而水稻3大病害包括稻瘟病、白葉枯病及稻紋枯病，其中稻瘟病是水稻生產上威脅最大的病害之一，由真菌梨抱霉菌感染引起，可發生在水稻整個發育時期。由于該病流行速度快，在適宜的環境條件下，短時間內即可造成大流行，給水稻生產帶來巨大損失。目前，農業上主要采取抗病育種和化學藥劑來逐漸控制稻瘟病。但由于稻瘟病菌的遺傳背景復雜，易變異，抗病品種難跟上致病菌生理小種的變異速度，常常導致一個新的具有抗病性的水稻品種在種植幾年后喪失抗性。而化學防治，不僅會污染環境，降低水稻質量，破壞生態，還導致病菌的耐藥性不斷增加從而降低防效。因此，探索新的方法來控制和解決稻瘟病越來越受關注。因此尋找稻瘟病有效的、低毒性、不受病原菌抗性影響的生物防治途徑對于糧食安全至關重要。

發明內容

根據現有技術中存在的問題，本發明提供了一種稻瘟病的生物防治方法，具有低毒性、不受病原菌抗性影響，且對稻瘟病菌的抑制率高等優點。

本發明采用以下技術方案：

一種稻瘟病的生物防治方法，包括以下步驟：

步驟一：選取健康水稻葉片，剪成5cm的葉段，放入裝有質量濃度75％乙醇的三角瓶中振蕩洗滌2次后倒掉乙醇，加入無菌水浸泡30min后梯度稀釋，得梯度稀釋液；

步驟二：制備NA固體培養基，采用蛋白胨10.0g、牛肉粉3.0g、氯化鈉5.0g、瓊脂15.0g、葡萄糖2.5g，加蒸餾水溶解，定容至1L，PH調至7±0.1，分裝后121℃滅菌20min；

步驟三：吸取梯度稀釋液涂布于NA固體培養基上，待吹干后，在30℃的恒溫培養箱中倒置培養48h，挑取單菌落，在NA固體培養基上梯度劃線再次獲得單菌落，將獲得的單菌落保存于NA固體培養基試管斜面備用；

步驟四：制備LB液體培養液，在950ml去離子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g，攪拌直至溶質溶解，用5mol/LNaOH調pH至7.0，用去離子水定容至1L，在15psi高壓下蒸汽滅菌21min；

步驟五：NA固體培養基試管斜面上挑取單菌落，接種于LB液體培養液中，在180rpm、37℃的條件下振蕩培養48h，然后在4℃、10000rpm/min離心15min，去除菌體，保留上清液，取500mL上清液溶于500mL、飽和度為80％的(NH₄)₂SO₄溶液中，放于4℃冰箱靜置48h，析出絮凝狀沉淀物，所述的絮凝狀沉淀物再次在4℃，10000rpm/min離心15min，棄去上清液，保留沉淀物，用500mLPBS緩沖液懸浮沉淀物，并置于透析袋中透析過濾，析出物經過0.22um的細菌濾膜過濾，得到粗提蛋白質液；

步驟六：水稻種子用質量濃度70％的乙醇溶液浸泡2min，然后用質量濃度3％的次氯酸鈉水溶液浸泡30min，期間用玻璃棒攪動，無菌水沖洗3次，第3次沖洗持續10min，過夜干燥，置于鋪有兩層濕潤濾紙片的培養皿中，再放于37℃恒溫培養箱培養4d直至發芽，最后將發芽的水稻種子播種于田地，在水稻生長的第10、20、50和80天向水稻葉面噴灑粗提蛋白質液。

優選的，步驟一中所述的梯度稀釋共稀釋2次，每次稀釋2倍。

優選的，步驟五中所述的所述的透析袋規格為25KD。

優選的，所述的單菌落為芽胞桿菌。

本發明的有益效果在于：

1)芽胞桿菌能夠分泌抗菌物質來抑制病原菌生長，并誘導植物防御系統抵御病原菌入侵，供試菌株對稻瘟病菌分生抱子的萌發、芽管的延長和附著胞的形成具有顯著的抑制作用，本發明的菌株活性物質對稻瘟病菌有較強的抑制作用，對稻瘟病菌菌絲生長抑制率達到80％以上。

2)本發明的方法可以調控水稻植株的生長發育進程，包含有益的細茵群落在植株生長中具有促生、抗病、抗逆等功能。根據植物微生態理論，這些細菌和宿主之間在長期的進化過程中能夠建立互惠互利的關系。從生物間巧生互作等關系考慮，這些細菌將更有利于生物的定殖，可更好地發揮生防作用。

3)本發明采用生物防治是發展綠色水稻產業的重要手段，芽胞桿菌是防治稻瘟病的重要生防微生物。從植物中尋找具有生物活性的化合物，直接將其發成為新農藥，是目前農藥研發的一條重要途徑。

具體實施方式