[發明專利]一種稻瘟病的生物防治方法

在審

• 申請號: 201710873279.8
• 申請日: 2017-09-25
• 公開（公告）號: CN107964515A
• 公開（公告）日: 2018-04-27
• 發明（設計）人: 章云;張貝尼
• 申請（專利權）人: 安徽省中日農業環保科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P21/00;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;A01N63/02;A01N63/00;A01P21/00;A01P3/00;A01C1/00;A01G22/22;C12R1/07
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所11308
• 代理人: 范奇

1.一種稻瘟病的生物防治方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一：選取健康水稻葉片，剪成5cm的葉段，放入裝有質量濃度75％乙醇的三角瓶中振蕩洗滌2次后倒掉乙醇，加入無菌水浸泡30min后梯度稀釋，得梯度稀釋液；

步驟二：制備NA固體培養基，采用蛋白胨10.0g、牛肉粉3.0g、氯化鈉5.0g、瓊脂15.0g、葡萄糖2.5g，加蒸餾水溶解，定容至1L，PH調至7±0.1，分裝后121℃滅菌20min；

步驟三：吸取梯度稀釋液涂布于NA固體培養基上，待吹干后，在30℃的恒溫培養箱中倒置培養48h，挑取單菌落，在NA固體培養基上梯度劃線再次獲得單菌落，將獲得的單菌落保存于NA固體培養基試管斜面備用；

步驟四：制備LB液體培養液，在950ml去離子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g，攪拌直至溶質溶解，用5mol/LNaOH調pH至7.0，用去離子水定容至1L，在15psi高壓下蒸汽滅菌21min；

步驟五：NA固體培養基試管斜面上挑取單菌落，接種于LB液體培養液中，在180rpm、37℃的條件下振蕩培養48h，然后在4℃、10000rpm/min離心15min，去除菌體，保留上清液，取500mL上清液溶于500mL、飽和度為80％的(NH₄)₂SO₄溶液中，放于4℃冰箱靜置48h，析出絮凝狀沉淀物，所述的絮凝狀沉淀物再次在4℃，10000rpm/min離心15min，棄去上清液，保留沉淀物，用500mLPBS緩沖液懸浮沉淀物，并置于透析袋中透析過濾，析出物經過0.22um的細菌濾膜過濾，得到粗提蛋白質液；

步驟六：水稻種子用質量濃度70％的乙醇溶液浸泡2min，然后用質量濃度3％的次氯酸鈉水溶液浸泡30min，期間用玻璃棒攪動，無菌水沖洗3次，第3次沖洗持續10min，過夜干燥，置于鋪有兩層濕潤濾紙片的培養皿中，再放于37℃恒溫培養箱培養4d直至發芽，最后將發芽的水稻種子播種于田地，在水稻生長的第10、20、50和80天向水稻葉面噴灑粗提蛋白質液。

2.根據權利要求1所述的一種稻瘟病的生物防治方法，其特征在于：步驟一中所述的梯度稀釋共稀釋2次，每次稀釋2倍。

3.根據權利要求1所述的一種稻瘟病的生物防治方法，其特征在于：步驟五中所述的所述的透析袋規格為25KD。

4.根據權利要求1所述的一種稻瘟病的生物防治方法，其特征在于：所述的單菌落為芽胞桿菌。