[發明專利]一種用于表達惡臭假單胞桿菌肌酐酶的酵母工程菌及其應用

在審

• 申請號: 201710872926.3
• 申請日: 2017-12-26
• 公開（公告）號: CN107663505A
• 公開（公告）日: 2018-02-06
• 發明（設計）人: 林影;梁書利;侯贛生
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N9/86;C12R1/84
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司44202
• 代理人: 王會龍

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，尤其涉及一種用于表達惡臭假單胞桿菌肌酐酶的酵母工程菌及其應用。

背景技術

肌酐酶(creatininase；EC 3.5.2.10)是一種水解酶，屬于脲酶相關的酰胺水解酶家族，分布于少數幾種細菌中。肌酐酶的活性中心含有鋅離子，肌酐酶的催化水解合成反應即催化環酰胺肌酐可逆的水解為肌酸。

血清中和尿液中肌酐測定可為臨床評價腎小球濾過功能提供客觀指標，因而是臨床上常做的生化檢驗項目，傳統的肌酐測定化學法由于反應特異性差，容易受到樣品中的非特異性物質的干擾，正在逐步被酶學方法所取代。肌酐酶作用的底物具有特異性，底物只能是肌酐或者是肌酸，酶法檢測肌酐有著反應特異性強，操作簡單的優點，而作為其中的一個關鍵酶，肌酐酶在醫學檢測上有重要的應用價值。

在自然環境中，惡臭假單胞菌、脲節桿菌和煙草節桿菌等微生物的代謝物中都有發現肌酐酶。目前研究比較多的肌酐酶大多是野生菌中的肌酐酶，但野生菌培養困難，肌酐酶產量低，比酶活低，提純存在困難。隨著酶法檢測肌酐試劑盒的開發，對于肌酐酶的需求越來越大，利用野生菌進行肌酐酶的生產難以實現工業化放大而且生產往往成本過高。

因此，構建出高表達具有良好性質的肌酐酶的工程菌，實現肌酐酶在工業中的生產，將可以大幅度降低生產成本。

發明內容

有鑒于此，本發明所解決的技術問題在于克服現有技術中不足，提供了一種用于表達惡臭假單胞桿菌肌酐酶的酵母工程菌及其構建方法。

本發明所解決的技術問題還在于提供了一種重組惡臭假單胞桿菌肌酐酶，利用本發明的酵母工程菌進行發酵而獲得。

本發明所解決的技術問題還在于提供了一種重組惡臭假單胞桿菌肌酐酶在肌酐檢測中的應用。

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種用于表達惡臭假單胞桿菌肌酐酶的酵母工程菌，所述酵母工程菌是通過將含有如下外源DNA的表達載體轉化到畢赤酵母而獲得：

所述外源DNA為惡臭假單胞桿菌肌酐酶的DNA編碼序列，所述惡臭假單胞桿菌肌酐酶的氨基酸序列如Seq No.2所示。

優選地，所述外源DNA序列如Seq No.1所示。

優選地，所述表達載體為將所述外源DNA克隆至巴斯德畢赤酵母表達載體pHKFA1，得到的表達載體pHKFA1-cre。

優選地，所述酵母工程菌是所述表達載體pHKFA1-cre線性化后轉化到巴斯德畢赤酵母而得。

相應地，本發明還提供一種用于表達惡臭假單胞桿菌肌酐酶的酵母工程菌的構建方法，包括如下步驟：

步驟一、編碼基因的獲?。阂詯撼艏賳伟麠U菌肌酐酶的氨基酸序列為基礎，對序列按照畢赤酵母的密碼子偏好性進行優化，得到密碼子優化的對應編碼序列；惡臭假單胞桿菌肌酐酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其編碼序列如SEQ ID NO.1所示；

步驟二、表達載體的構建：將步驟一獲取的編碼基因克隆至巴斯德畢赤酵母表達載體pHKFA1，得到的表達載體pHKFA1-cre；

步驟三、表達載體轉化及酵母工程菌獲?。簩⒈磉_載體pHKFA1-cre經Kpn2I單酶切線性化并純化后電轉化畢赤酵母工程菌GS115感受態細胞，培養后篩選陽性轉化子，并對篩選的陽性轉化子進行鑒定，鑒定正確的轉化子即為畢赤酵母工程菌GS115/pHKFA1-cre。

優選地，陽性轉化子的篩選是在MD平板進行。

優選地，對陽性轉化子進行的鑒定以cre-F和cre-R為引物進行PCR鑒定，其中cre-F的序列如Seq No.3所示，cre-R的序列如Seq No.4所示。

另外，本發明還提供了一種重組惡臭假單胞桿菌肌酐酶，其特征在于：該重組惡臭假單胞桿菌肌酐酶是由上述方案中揭示的酵母工程菌進行發酵而獲得。

優選地，其發酵方法為如下：挑取重組畢赤酵母工程菌接種到BMGY培養基，30℃，250rpm培養至OD600接近6.0，于6000rpm,4℃離心5min收集細胞，然后將收集的細胞重懸到BMMY培養基至起始OD600接近1.0，于30℃，250rpm震蕩培養，每天補加終濃度1％甲醇；發酵六天后在6000rpm，4℃離心5min回收發酵上清液；用親和層析方法對發酵上清液的重組肌酐酶進行純化即可；所述BMMY培養基中含有0.1mM CuSO₄。

再則，本發明還提供了一種本發明的重組惡臭假單胞桿菌肌酐酶在肌酐檢測中的應用。

與現有技術相比，本發明優點在于：