[發(fā)明專利]一種用于表達(dá)惡臭假單胞桿菌肌酐酶的酵母工程菌及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710872926.3
• 申請(qǐng)日: 2017-12-26
• 公開（公告）號(hào): CN107663505A
• 公開（公告）日: 2018-02-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林影;梁書利;侯贛生
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華南理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N15/81;C12N9/86;C12R1/84
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司44202
• 代理人: 王會(huì)龍

1.一種用于表達(dá)惡臭假單胞桿菌肌酐酶的酵母工程菌，其特征在于，所述酵母工程菌是通過將含有如下外源DNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到畢赤酵母而獲得：

所述外源DNA為惡臭假單胞桿菌肌酐酶的DNA編碼序列，所述惡臭假單胞桿菌肌酐酶的氨基酸序列如Seq No.2所示。

2.如權(quán)利要求1所述的用于表達(dá)惡臭假單胞桿菌肌酐酶的酵母工程菌，其特征在于：所述外源DNA序列如Seq No.1所示。

3.如權(quán)利要求2所述的用于表達(dá)惡臭假單胞桿菌肌酐酶的酵母工程菌，其特征在于：所述表達(dá)載體為將所述外源DNA克隆至巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體pHKFA1，得到的表達(dá)載體pHKFA1-cre。

4.如權(quán)利要求3所述的用于表達(dá)惡臭假單胞桿菌肌酐酶的酵母工程菌，其特征在于：所述酵母工程菌是所述表達(dá)載體pHKFA1-cre線性化后轉(zhuǎn)化到巴斯德畢赤酵母而得。

5.一種用于表達(dá)惡臭假單胞桿菌肌酐酶的酵母工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一、編碼基因的獲取：以惡臭假單胞桿菌肌酐酶的氨基酸序列為基礎(chǔ)，對(duì)序列按照畢赤酵母的密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化，得到密碼子優(yōu)化的對(duì)應(yīng)編碼序列；惡臭假單胞桿菌肌酐酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其編碼序列如SEQ ID NO.1所示；

步驟二、表達(dá)載體的構(gòu)建：將步驟一獲取的編碼基因克隆至巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體pHKFA1，得到表達(dá)載體pHKFA1-cre；

步驟三、表達(dá)載體轉(zhuǎn)化及酵母工程菌獲取：將表達(dá)載體pHKFA1-cre經(jīng)Kpn2I單酶切線性化并純化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母工程菌GS115感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后篩選陽性轉(zhuǎn)化子，并對(duì)篩選的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定，鑒定正確的轉(zhuǎn)化子即為畢赤酵母工程菌GS115/pHKFA1-cre。

6.如權(quán)利要求5所述的用于表達(dá)惡臭假單胞桿菌肌酐酶的酵母工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于：陽性轉(zhuǎn)化子的篩選是在MD平板進(jìn)行。

7.如權(quán)利要求5所述的用于表達(dá)惡臭假單胞桿菌肌酐酶的酵母工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于：對(duì)陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行的鑒定以cre-F和cre-R為引物進(jìn)行PCR鑒定，其中cre-F的序列如Seq No.3所示，cre-R的序列如Seq No.4所示。

8.一種重組惡臭假單胞桿菌肌酐酶，其特征在于：該重組惡臭假單胞桿菌肌酐酶是由權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的酵母工程菌進(jìn)行發(fā)酵而獲得。

9.如權(quán)利要求8所述的重組惡臭假單胞桿菌肌酐酶，其特征在于，其發(fā)酵方法為如下：挑取重組畢赤酵母工程菌接種到BMGY培養(yǎng)基，30℃，250rpm培養(yǎng)至OD600接近6.0，于6000rpm,4℃離心5min收集細(xì)胞，然后將收集的細(xì)胞重懸到BMMY培養(yǎng)基至起始OD600接近1.0，于30℃，250rpm震蕩培養(yǎng)，每天補(bǔ)加終濃度1％甲醇；發(fā)酵六天后在6000rpm，4℃離心5min回收發(fā)酵上清液；用親和層析方法對(duì)發(fā)酵上清液的重組肌酐酶進(jìn)行純化即可；所述BMMY培養(yǎng)基中含有0.1mM CuSO₄。

10.一種如權(quán)利要求8或9所述的重組惡臭假單胞桿菌肌酐酶在肌酐檢測(cè)中的應(yīng)用。