[發明專利]中斷缺失的高產安絲菌素菌株及其制備方法

在審

• 申請號: 201710871241.7
• 申請日: 2017-09-25
• 公開（公告）號: CN107881138A
• 公開（公告）日: 2018-04-06
• 發明（設計）人: 于麗潔;白林泉;寧新娟;郭舒揚
• 申請（專利權）人: 遼寧斯韋爾生物科技有限公司;上海交通大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P17/18;C12R1/465
• 代理公司: 沈陽科威專利代理有限責任公司21101
• 代理人: 王勇,趙霎

技術領域

本發明涉及生物醫藥領域，具體說是一種高產安絲菌素的菌株以及該菌株的制備方法，該方法主要是通過敲除珍貴束絲放線菌ATCC31280基因組中N位糖基轉移酶的表達基因ansa30，以消除N位糖基化對N位甲基化途徑的競爭作用，使氨甲酰化安絲菌素糖苷ACGP-3積累消失，而代謝流更多的流向目標產物，從而提高了安絲菌素的產量。

背景技術

安絲菌素(又名安絲霉素或安莎霉素)是由珍貴束絲放線菌（Actinosynnema pretiosum）產生的一種大環內酰胺類抗生素，屬于微生物來源的美登素類分子，其組分有P-0、P-1、P-2、P-3、P-3'、P-4 和P-4'，其中安絲菌素P-3（AP-3，1）為主要發酵產物，安絲菌素能夠與微管蛋白的β亞基結合，通過阻礙微管形成，從而抑制腫瘤細胞的有絲分裂使細胞死亡，在體外及荷瘤動物中具有顯著的抗腫瘤作用。例如，ImmunoGen，Inc.公司的Chari等人通過在C-3位酯鏈上連接二硫鍵形成的DM1分子，經DTT還原后可與不同的抗體連接形成抗體結合分子。目前，安絲菌素多種DM1抗體結合分子已經進入不同的臨床實驗階段。其中，由羅氏公司開發的用于治療人類乳腺癌的Trastuzumab Emtansine（即T-DM1）已經成藥上市。

現有技術中，其中一種安絲菌素生物合成的方法主要包括起始單元3-氨基-5-羥基苯甲酸（AHBA）的合成（葡萄糖為前體），隨后在I型聚酮合酶（PKS I）催化作用下，加載7個延伸單元-3個乙酸單元（丙二酰CoA提供），3個丙酸單元（甲基丙二酰CoA提供），1個糖基（Glycolate）延伸單元（2-羥甲基-ACP提供，來源于糖酵解途徑），形成十九元大環內酰氨，最后經過一系列的后修飾過程，包括：氯代、氧甲基化、氨甲酰化、酰化、環氧化、N-甲基化（SAM依賴）形成安絲菌素。但是，其中由糖基轉移酶ansa30催化的N-糖基化反應為N-甲基化反應的競爭途徑，導致ATCC31280液體發酵液中，分支產物-氨甲酰化安絲菌素糖苷ACGP-3（4＂-O-carbamoyl-ansamitocinoside P-3）積累。副產物的形成影響了目標產物的產量。

發明內容

本發明的目的是提供一種高產安絲菌素的菌株、該突變株的制備方法以及通過該突變株高產安絲菌素的方法。該突變株基于中斷N-甲基轉移酶表達基因ansa30的表達，以消除代謝途徑中N糖基化對N甲基化的競爭，將代謝流更多地導向目標產物的合成，從而提高安絲菌素的產量。

為此，本發明提供了如下技術方案：

一方面，本發明提供了一種中斷缺失的高產安絲菌素的菌株，其技術要點是：所述菌株的N位糖基轉移酶基因ansa30不表達。

進一步的，突變株（NXJ-22）由菌株ATCC31280制備得到。

另一方面，本發明還提供了該中斷缺失的高產安絲菌素菌株的制備方法，其技術要點是，包括以下步驟：

步驟1）構建用于ansa30中斷缺失的同源重組質粒載體；

步驟2）將步驟1）構建得到的質粒載體通過接合轉移導入受體菌中進行同源重組；

步驟3）通過驗證硫鏈絲菌素抗性或PCR產物片段大小的差異的方法篩選ansa30基因中斷缺失的突變株。

進一步的，質粒載體由質粒pJTU1278制備。

進一步的，受體菌為ATCC31280。

進一步的，步驟1）中，由兩組引物通過PCR擴增得到ansa30中斷區域左側及右側的同源臂。

進一步的，步驟1）中，在質粒SpeI/HindIII位點插入中斷區域左側1440bp的PCR片段 (SpeI/EcoRI)，在中斷區域右側1465bp的PCR片段(EcoRI /HindIII)。

左同源臂的序列為：