[發(fā)明專利]中斷缺失的高產(chǎn)安絲菌素菌株及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710871241.7
• 申請日: 2017-09-25
• 公開（公告）號: CN107881138A
• 公開（公告）日: 2018-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 于麗潔;白林泉;寧新娟;郭舒揚(yáng)
• 申請（專利權(quán)）人: 遼寧斯韋爾生物科技有限公司;上海交通大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P17/18;C12R1/465
• 代理公司: 沈陽科威專利代理有限責(zé)任公司21101
• 代理人: 王勇,趙霎

1.一種中斷缺失的高產(chǎn)安絲菌素菌株，其特征在于：所述菌株的N位糖基轉(zhuǎn)移酶基因ansa30不表達(dá)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中斷缺失的高產(chǎn)安絲菌素菌株，其特征在于：出發(fā)菌株為ATCC31280。

3.一種中斷缺失的高產(chǎn)安絲菌素菌株的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1）構(gòu)建用于ansa30中斷缺失的同源重組質(zhì)粒載體；

步驟2）將步驟1）構(gòu)建得到的質(zhì)粒載體通過接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入受體菌中進(jìn)行同源重組；

步驟3）通過驗證硫鏈絲菌素抗性或PCR產(chǎn)物片段大小的差異的方法篩選ansa30基因中斷缺失的突變株。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的安絲菌素高產(chǎn)菌株的制備方法，其特征在于：質(zhì)粒載體由質(zhì)粒pJTU1278制備。

5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的安絲菌素高產(chǎn)菌株的制備方法，其特征在于：受體菌為ATCC31280。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高絲菌素高產(chǎn)菌株的制備方法，其特征在于：步驟1）中，由兩組引物通過PCR擴(kuò)增得到ansa30中斷區(qū)域左側(cè)及右側(cè)的同源臂。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的安絲菌素高產(chǎn)菌株的制備方法，其特征在于：步驟1）中，在質(zhì)粒SpeI/HindIII位點(diǎn)插入中斷區(qū)域左側(cè)1440bp的PCR片段 (SpeI/EcoRI)，在中斷區(qū)域右側(cè)1465bp的PCR片段(EcoRI /HindIII)。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的安絲菌素高產(chǎn)菌株的制備方法，其特征在于，左同源臂的序列為：

CCGACGACTGACCCGCCACCGGGGACGGGGGCCGACCGGAATCCCGGTCGGCCCCCGTCCGCGTTCCAGGGGGGGGCGAGTCACGCGGGTTCAGGACCGGGCCGCGCGCACCCCGTCCCGCACCGCCCCCGTCACCCGGTGCGCCCCGCTCACCAGCGAGGTCACCAGCTCCCCCGGCCTGGGCGCCCGAGCCAGCAGCGCCGTCACCGGGCTGGACTCCAGCACCCGCCCCGGATACGCCCCGTGCACCCGCCCGTCCTCGTCCACCGGCGAGTCCACGTTGTCCACGCCGTTGTCCGGCAGCTCCGACCGCATCCCCGACCGGCCGACCGCGCGCACCGACATCAGCGCGTCCGTGAGCGCCGGGAACAGCCGCTGCCCCAGGTAGAACGCGAGCGCCGCGTCACCCACCGGCACCTCGCGGCGGGGGCGTTCGGCGGCGCGCAGCACGGCCTCAGCGACCAGCTCCGGCGCGTACACCGGAGGCGGCGGCTCGGGCAGCGAGCCGACGCGGCTGCGGCAGTGCTCGAAGAACGGGCTGTTGATCGCGGCGGGCAGCACGGCGGTGACCGCGATCGGCTCGCCGTCGTGGGCCAGCTCCACCCGCAGCGCGTCGTAGAACGCCCGCACCGCCGCCTTGCTGGCCGCGTACGGGGCCTGGAGCGGCGCCGAGCGCAGCCCGAGCACGGACGCGACCCCGATCAGCACTCCTCCGCCCGCCCGGCGCAGCGCGGGCAGCGCGGCCTTGGCCCCGTGCACGTGCCCGAGGTAGTTGACCCGCATCACCCGGTCGAACTCCTCGGCGGGGGTGTCCTCCACCCGCCCGTACACGCCGATCCCGGCCGCGTTCACCCAGGTGTCCACCCGCCCGAACCGCTCCACCGCCACCTCGGCGACCGCGCGCACCGCGGCCTCGTCGGCGATGTCCGCCGTCACCGCGACCGCAGGCCCACCCGCGTCCCGGACCTCCTCGACCAGCCCGTCGAGCGCGCGGGTGTTGCGCGCCGCGCACACCACGCGCGCCCCCGCCGCCGCGAACCGCAGCGCGGTGACCCGCCCGATCCCCGACGACGCGCCCACCACGACGACGACCTGCTCCGCCAACCTCCTGGGCATGTGACCTCTCCGTCCCGGATCGTGAAATGCGGCGGGTACCCGGCGGGAGGCCGTCCACGCGTCCCGGAGGGATGGTCCGCGCGGACGGCGGGTGGTCCGGATCGGAGGCGGGCCCTCGACCCCGGCAGTCCGATCAGCGCACGACCGACCAGGGCGCGGCCGTCCAGCGCACGACCATCCAGCACGCGACCGACCAGGGCGCGACCGACCAGCACGCGGCCGTCCGCCCCGGACCCGGACACCCGGCACCCCGCACGGCCCGCGCGGTCACACCGCCGCGACGCTCCGCGCGGCCTCCGCGATCTGCTCCAGGCGGGTCACCAC；

或者/和右同源臂的序列為：

GACGGTCAGGCAGGGCAGCCCGCGCTCCTCCGCGACGAGCAGCCCGGCCAGCTCCATGCCGTCGCGCAGGACCAGGTCGGGCCGGAAGCGGTCGACGACGGGGCGCAGCCCGGCCAGCGCCTCCCGCAGCAGCGGCCTGCCCGCGATGACGTCGACGATCGCGTCGACGCCGGGGTAGTCGGTGCCCGGCCTGGCCGGTGGCACGACGCCCCCGAGCCGCTCCACCCAGAACCTCGCCTGGTCGGGCAGCGCCTCGACCGAGGGCAGGCCGCTGCCCCGCAGGCCCGGTGCGGCGCTGGGGGCCGTGGCCACGAGCACCTCGTGCCCGGCGTCCAGGACCGCGCGCCCGAGCACGAGCATCTCGTGCGCGTGCGACGGGGCCCCGGTGACGGTGAACAGAACGCGCAACTGTCTTCCTCCGTGCTGGGGCCCGCCGCGCGGCGGGCCCCGGTGGTGAAGGGCCGCGGGTGCGGCCCCGAACCGGTCAGGTCCGCTCGGCGCGGCCCAGCCGGGTGTCGATGAACTCGAACAGCTCCGCCACGCCCGCGTCCCGGAGCGCGGCCCCGCCGTCGGGCTCGCCCTGGTCCTCGTCGGACAGGGCGGCGAGCAGGGCGCGCAGCCTGGCGGCGGCGCTCGCGCGCAGCGCGGGGTCGGCGGGCGGGTCGGCGAGCGCGGCCTCCAGGCGGTCCAGGCCCGAGGTCACCGGGTCGCCGCCGTCGAGCAGCCCCGCCAACACGGCGGCGACCTCGGCCGCCGTCGGGTGGTCGAACAGCAGGGTCGCGGGCAGGGTCAGGCCGGTGGCGGCGGCCAGGCGGTCGCGCAGCTCCACCGCCGTCATCGAGTCGAACCCCAGGTCCCGGAACGCGGCCCGCCCGTCCACCGAACCGTCGGCGCGGCCCAGCACGGCGGCGGCGTGGTCGCGCACCAGCGCCAGCAGCACCCGGTCCCGGTCCGGGCCGGTCAGGTCGACCGCGCTCGGCTCCGGGGCGCTCCGCTGCTCGGGCAGCGCCACCCCTGGCAGCGCCCCCTCGGACAGCACTCCCCCGGACAGCGCGGCTTCCGACGTCCGCGCGAACACGACCACGCCCAGCTCCGGGCTCAGCGGCGGCACACCCGGTCCCGCGCACAGCAGGGTCGCGGGCAGGCCGTCCTCGTGGCGGCGGCGCACGAGCGCGGCCAGCACCCCGGCGGCCACCGCGTCCTCGGGGCGCGCCGCGTCGCCGAGCGCGCCCGCCGGGCCGCACAGCGCGAACAGCGCGGGCGGCCGGTCGCGGGTCAGCTCGTCCAGCAGCGCGGCCCGCGCCAGGCCCGCGTCGTCCGGCTCGACGGCGAGCACCACCCAGTCCGGGCGGTGCCCCTCCAGCGCGGCCACCAGCTCCTCCCTGCCGGGGTCGGCGGGCAGCACGACCGGTTCGCGCACCCCGCAGGCCGCCACCACGCCGCGCGCCGCCTCCCCGACCACCAG。