[發明專利]一種極地益菌元的制備方法及其應用

在審

• 申請號: 201710866203.2
• 申請日: 2017-09-22
• 公開（公告）號: CN107418924A
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發明（設計）人: 陳憲;劉旸;李智;楊明;陳暢鳴
• 申請（專利權）人: 福州大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/16;A23K10/18;C12R1/225
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明屬于水產飼料添加劑領域，具體涉及一種極地益菌元的制備方法及其應用。

背景技術

隨著國內經濟的持續發展，對水產養殖業可持續發展的需求不斷提高，高密度養殖模式以及抗生素濫用問題嚴重影響著水產養殖業的發展，長期以往，導致養殖生態環境失調，各種病害頻繁發生。再者，抗生素在水產動物體內長期積累，也對人類健康產生一種潛在威脅。因此，改變養殖模式，尋找抗生素的替代品勢在必行。

極地益菌元是新型、可替代抗生素的產品，具有健康無污染的特點，長期使用可以有效地改變養殖水體微環境，調節水產動物腸道菌群平衡，從而保障了生物體正常生長。因此，具有重大的經濟和社會意義。

乳桿菌，革蘭氏陽性菌，可以有效降低水產動物腸道pH值，從而抑制其它致病菌的生長繁殖，既調整腸道菌群平衡，促進機體對營養物質的消化吸收，又能提高機體的免疫能力。乳桿菌作為動物和人胃腸道的優勢菌落，是公認的有益菌。將乳桿菌應用于水產養殖行業是解決水產養殖物存活率低等問題的一個有效途徑。

酵母菌，含有豐富的蛋白質和維生素，是水產飼料的優良添加劑，對水產動物具有誘食、促進生長、提高免疫的作用。抗菌肽具有廣譜的殺菌作用，是天然免疫系統的重要組成部分，可有效殺滅有害致病菌，又不易誘導耐藥性，但是天然的抗菌肽含量極少，不能滿足人類的需要。經過修飾魚類抗菌肽hepcidin和兩棲動物抗菌肽maginin所組成的融合蛋白抗菌肽酵母，是一種具有抗菌、免疫功能并以基因工程構建的新型飼料添加劑。

低溫芽孢桿菌，革蘭氏陽性菌，菌體桿狀，多數運動，產芽孢。低溫芽孢桿菌在惡劣環境中的生存力較強，并且具有多種高效的酶促效應。優質的低溫芽孢桿菌可以迅速降解養殖水體中的各種有機物，包括殘留餌料、水產動物的排泄物、死亡生物的殘體及池底淤泥中的有機物，除此之外，還能降低水體中的氨氮與亞硝態氮的含量、增加溶解氧的含量，進而有效地改良水質，營造良好的養殖生態環境。將具有明顯抑菌活性和低溫酶活性的低溫芽孢桿菌應用于水產養殖行業是解決抗生素污染問題的一個有效方案。

單一的益菌元不能滿足多種養殖對象和養殖環境的要求，制備復合型極地益菌元是解決水產養殖問題的有效途徑。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于水產養殖的極地益菌元及其制備方法和應用，既能提高幼魚存活率，又能改善養殖水質，在水產養殖方面具有廣闊的市場前景。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種用于水產養殖的極地益菌元的制備方法：包括以下步驟：

1）低溫芽孢桿菌、低溫乳桿菌以及抗菌肽酵母的培養：將低溫芽孢桿菌、乳桿菌以及抗菌肽酵母菌種從試管斜面培養基中取出，分別接種到裝有液體培養基的錐形瓶中，然后置于搖床中，于20℃、150-250r/min條件下培養24h；

2）將步驟1）處于對數期的低溫芽孢桿菌菌液、乳桿菌菌液以及抗菌肽酵母菌液按1：1：1的比例接種到發酵培養基中進行發酵，發酵溫度為20℃，發酵時間為48-72h；

3）將步驟2）處于穩定期的菌株發酵液于10000r/min離心20min，以分離菌體與上清液；將所得菌體共同加入保護劑中攪拌混勻，其中菌體與保護劑的體積比為1：3，再經真空冷凍干燥制得所述極地益菌元。

步驟1）中低溫芽孢桿菌所用的液體培養基配方為：每1000mL蒸餾水中含蛋白胨2-8g、酵母粉0.5-3g；pH值7.4-7.8，使用前于121℃滅菌15-20min；乳桿菌所用液體培養基為MRS培養基，抗菌肽酵母所用液體培養基為PDA培養基，使用前于121℃滅菌15-20min。

步驟2）中乳桿菌菌液、乳桿菌菌液以及抗菌肽酵母菌液的接種量均為2vol%，三者所用發酵培養基配方為：每1000mL蒸餾水中含可溶性淀粉3-3.5g、蛋白胨10-12g、酵母膏3-5g、KH₂PO₄ 1.5-4g、KHPO₄ 2-4g、MgSO₄ 0.1-1g、ZnCl₂ 1-3g；pH值7.4-7.6，使用前于121℃滅菌15-20min。

步驟3）中所述保護劑由低聚木糖、低聚殼聚糖、β-葡聚糖、海藻糖、維生素C、脫脂乳及水組成，可減輕或避免冷凍干燥對細菌帶來的損傷，提高存活率；其中，低聚木糖和β-葡聚糖的濃度均為1.5-2.5g/L，低聚殼聚糖0.3-0.6 wt%, 海藻糖的濃度為3-6wt%，維生素C的濃度為0.08-0.12wt%, 脫脂乳的濃度為16-22wt%。